禽网状内皮组织增生症病毒env基因的原核表达及其多克隆抗体制备

为原核表达禽网状内皮组织增生症病毒(REV)env蛋白及制备抗env蛋白的高效价多克隆抗体,本研究以pMD18T-env(HLJR0901株)为模板,扩增得到REV的env全长基因,将其克隆于pET-32a(+)中。将阳性重组质粒pET-env转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,复性后免疫BALB/c小鼠,制备抗env多克隆血清。SDS-PAGE及western blot结果表明,env基因以融合蛋白形式获得正确表达,相对分子质量约为84ku,表达产物具有良好免疫原性;IFA结果显示,制备的抗env多克隆血清能与REV野毒株特异性反应;ELISA效价达到1∶105以上。该研究为REV的检测及env蛋白的深入研究奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30蛋白的表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21（DE3）菌,经IPTG诱导,p30蛋白呈现可溶性表达。用表达产物免疫6周龄BALB/c小鼠,制备p30抗体,经Westernblot和间接免疫荧光法检测,结果发现,原核表达的SNV株p30蛋白具有良好的免疫原性。     

禽网状内皮组织增生症病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达

根据禽网状内皮组织增生症病毒（REV）SNV株的前病毒基因组cDNA序列，设计并合成1对引物，以SNV株前病毒CDNA全基因组克隆为模板，通过PCR技术，扩增出该病毒囊膜糖蛋白（env)gp90基因部分片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-5X-3载体中谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在1.0mmol/L IPTG(37℃）诱导下，gp90基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白相对分子质量为64000。将表达产物从凝胶中回收后免疫小鼠，所得的抗血清可与REV野毒株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在免疫荧光试验中起反应。由此表明，体外表达的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。     

禽网状内皮组织增生症病毒env蛋白的表达及其在ELISA方法中的应用

以pb101质粒为模板,PCR扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜糖蛋白env基因片段.构建原核表达质粒pGEX-4T-3-env后,转化入宿主菌BL21,IPTG诱导表达env蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果表明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性,相对分子质量约66.4 ku.将表达产物纯化后作为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法(Ienv-ELISA).经应用表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性,与IFA及iREV-ELISA结果相比其准确率均超过90%.该方法为检测REV抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段.     

禽网状内皮组织增生症病毒研究进展

禽网状内皮组织增生症病毒(Avian reticuloendotheliosis virus, REV)属于反转录病毒科正反转录病毒亚科γ反转录病毒属的一种具有包膜的单股正链RNA病毒。禽感染REV后引发急性网状细胞肿瘤、慢性淋巴肿瘤、矮小综合征等症状,导致鸡群大量死亡或发育不良,严重威胁着我国养禽业的安全。笔者从REV的病原学、流行病学、致病机理与防控方面进行综述,为REV的基础研究及防控提供科学参考。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis,RE）是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒（REV）实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,而且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

禽网状内皮增生症病毒gp90蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为获得分泌抗禽网状内皮增生症病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,通过表达pET32a-gp90重组蛋白,以纯化的gp90蛋白为抗原,免疫BALB/c鼠,筛选分泌抗REV McAb的杂交瘤细胞株.经过细胞的融合及筛选,共获得能稳定分泌抗REV gp90的McAb细胞系2株,分别命名为A9E8和B3F8.2株细胞培养上清的效价均在1:4×102以上,腹水效价均在1∶8×103以上.亚型鉴定结果表明,2株皆为IgG型,轻链均为k链;Western blot及间接免疫荧光结果显示,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能识别REV全病毒抗原,与其发生特异性反应,并且不与禽类其他病毒发生反应;病毒中和试验结果表明,获得的单克隆抗体均能REV临床分离株发生中和反应,具有较好的中和活性.利用制备的单克隆抗体建立了REV的间接免疫荧光检测方法,临床病料检测结果表明,该方法与病毒分离及PCR的检测结果基本一致,阴、阳性符合率分别为100％和90％.作者制备了针对REV gp90的McAb,为REV的快速诊断及抗原表位分析与鉴定等奠定了基础.     

口蹄疫病毒3B蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备

为了深入研究口蹄疫病毒3B蛋白的结构及功能,本研究原核表达了3B蛋白并制备了针对3B蛋白的多克隆抗体。试验采用PCR方法扩增了口蹄疫病毒3B蛋白基因,并将其克隆到pET28a载体上,构建了重组质粒pET28a-3B,将其转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达。经过Ni-NTA琼脂糖亲和层析法初步纯化及Millipore超滤浓缩进一步纯化,将其免疫试验动物新西兰大白兔后制备出了抗3B蛋白的多克隆抗体。通过ELISA检测了该多抗的效价,Western blot试验检测了其反应性,通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验检测了该多抗的应用性。结果表明:该抗体的效价为1∶512 000,反应性良好;IFA试验和Western blot试验中可以检测到过表达后定位于细胞核和细胞质中的3B蛋白,也可以检测到在真核细胞中过表达的3B蛋白。说明本研究制备的口蹄疫病毒3B蛋白多克隆抗体可以作为开展该病毒相关研究的重要材料。     

小鼠朊蛋白相关蛋白Shadoo的表达、纯化及多克隆抗体的制备

构建SPRN重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备,提取BALB/c小鼠全血基因组,PCR扩增SPRN基因,克隆至融合表达载体,在大肠埃希菌中表达鼠Shadoo蛋白并纯化;以纯化蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,并检测抗体效价,用Western blot方法分别检测与重组及内源性Shadoo蛋白的反应性.结果表明,成功制备了小鼠Shadoo蛋白兔源多克隆抗体,为研究Shadoo蛋白与PrP蛋白之间的功能调节关系,自身的生理学作用以及Shadoo蛋白在传染性海绵状脑病发病机制过程中的生物学功能奠定了良好的基础.     

禽流感病毒蛋白AM2的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

利用大肠杆菌BL21表达禽流感病毒蛋白AM2,分离纯化目的蛋白,进行小鼠免疫制备多克隆抗体。将A型禽流感病毒M2基因的原核表达重组质粒pGEX-6p-1-AM2转化大肠杆菌感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,在大肠杆菌表达系统中获得表达,并分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到了pGEX-6p-1-AM2的多克隆抗体。经western-blot免疫印迹分析,自制的多克隆抗体能特异地与AM2蛋白相互作用,这说明试验制备了特异性良好的抗AM2的多克隆抗体。     

马立克氏病病毒L-meq基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从潜伏期感染马立克氏病病毒的鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得了马立克氏病病毒的L-meq基因,与NCBI数据库已发表的序列(AB091109)相比,同源性达99%。将L-meq基因片段定向克隆到原核高效表达载体pET-28a中,构建pET-28a-L-meq重组质粒。将重组质粒转化受体菌Rosetta中,以IPTG对其进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果表明L-meq基因在E.coli Rosetta中得到了正确表达,薄层扫描分析表明,表达蛋白占细菌总蛋白的18.8%,将表达蛋白进行初步的纯化,制备了L-MEQ蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法对多克隆抗血清进行鉴定,结果表明其纯化的重组的L-MEQ蛋白具有良好反应原性和特异性。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒gag蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)gag蛋白和抗gag蛋白的多克隆抗体,根据GenBank已登录的ENTVgag基因序列,设计合成1对特异性引物,应用PCP扩增gag基因并连接于原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-gag,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达相对分子质量约为69 000的重组蛋白,重组蛋白经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western blot试验表明,重组蛋白能与制得的多克隆抗体反应,而与正常小鼠血清和山羊地方性鼻内肿瘤患羊血清不反应。本试验成功获得了纯化的ENTV gag蛋白和小鼠抗gag蛋白的多克隆抗体,为进一步研究gag蛋白在ENTV致病过程中的作用提供了材料。     

禽白血病病毒p27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备

将禽白血病病毒p27基因克隆并构建重组表达质粒pET28a-p27,在大肠杆菌BL21中经IP TG诱导后产生可溶性表达蛋白。表达的蛋白用Western blot进行活性检测,其能与辣根过氧化物酶标记的兔抗p27抗体发生特异性反应;采用金属螯和层析对表达蛋白进行纯化,其纯度约为95％;用纯化的表达蛋白p27免疫家兔制备抗血清,ELISA抗体效价可达1∶25600。研究结果表明,大肠杆菌表达的p27蛋白具有良好的抗原性,可以替代纯化病毒蛋白用于禽白血病病毒检测。     

马立克病毒UL36~（USP）蛋白的表达及其抗体制备

UL36USP是马立克病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段（UL36USP）,本试验以提取MDCC-MSB1细胞的基因组为模板通过PCR获得目的基因,将UL36USP基因克隆入pMD18T载体,测序正确并酶切鉴定后,将目的基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UL36USP。将重组质粒转化BL21（DE3）E.coli中,IPTG诱导表达并使用Ni-NTA Agarose亲和层析进行纯化得到目的蛋白。应用纯化后的UL36USP免疫獭兔制备多克隆抗体。使用昆虫细胞表达系统表达的UL36片段检测多克隆抗体的特异性。结果显示成功制备特异性的UL36USP抗体。     

马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。     

禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。