小立碗藓PpCASLUU3基因敲除载体的构建

【目的】为探明PpCASLUU3是否参与灰霉菌引起的小立碗藓中类过敏反应,构建PpCASLUU3-PTN182敲除载体,对早期登陆植物防卫防御的进化提供依据。【方法】根据同源重组的原理,以小立碗藓基因组DNA为模板,利用Primer 5设计的引物,扩增得到小立碗藓PpCASLUU3基因的上、下游同源臂基因片段。将上下游同源臂基因分别克隆到pMD-19T上,测序验证,使用EcoR I、EcoR V酶切含上游目的基因的pMD-19T获得上游目的基因片段,使用BamH I、Sma I酶切含下游目的基因的pMD-19T获得下游目的基因片段,同时酶切PTN182载体,经T_4-DNA连接酶连接,转入大肠杆菌感受态,筛选出阳性克隆,采用相同的方法,将下游臂连入PpCASLUU3.1-PTN182载体。【结果】经PCR检测、酶切验证,获得了完整的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除载体。经测序分析,插入序列PpCASLUU3.1和PpCASLUU3.2与未插入前相似度分别为100%和99.63%。【结论】PpCASLUU3-PTN182敲除载体构建成功。     

小立碗藓CAD1基因敲除载体的构建及酶切方法优化

苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,Real-TimePCR表达分析表明,小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术,以小立碗藓基因组DNA为模板,使用Primer5-Cracked设计的引物,扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒,经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌,筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证,得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182,即得CAD11-pTN182-CAD12,最后进行测序分析。结果表明,已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体,并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用,可为后续进行小立碗藓CAD1基因敲除,验证小立碗藓CAD1基因功能,进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。     

小立碗藓代谢与发育研究进展

小立碗藓（PhyscomitreUapatens）是目前发现的唯一具有高频率同源重组特性的植物,是研究植物代谢和发育的理想的模式系统。本文从生育周期、代谢和发育方面综述了其研究进展。     

小立碗藓细胞色素P450基因PpCYP51G1的分离及转化载体构建

从小立碗藓（Physcomitrella patens）中克隆了细胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1的全长编码序列,编码区长1509bp,预测编码488个氨基酸,蛋白二级结构含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋,N端含有一个跨膜区域。构建了PpCYP51G1的功能缺失载体,并利用PEG介导的原生质体转化技术获得该基因的功能缺失转化体;同时,构建了印CYP51G1-GFP融合蛋白载体,亚细胞定位结果表明,PpCYP51G1定位在内质网中。     

潮霉素对小立碗藓生长的影响

目前,小立碗藓已经成为一种重要的功能基因组学研究的模式植物。将小立碗藓接种于含不同浓度潮霉素的BCDATG培养基上,观察小立碗藓对不同浓度潮霉素的敏感程度。结果表明:随着潮霉素浓度的增加,小立碗藓的生长受到不同程度地抑制。因此,潮霉素可以作为一种筛选标记对转基因小立碗藓进行筛选。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

小立碗藓PpCAD4基因敲除载体的构建及功能研究

木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD）是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株。qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%, cad4-ko菌丝入侵率为40%。侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。     

小立碗藓原生质体细胞壁再生过程观察

[目的]小立碗藓具有遗传背景清楚、活体观察方便、生活史短、再生能力强等特点,是研究发育的理想模式植物.[方法]应用0.5％的崩溃酶将生长7d的原丝体酶解,得到新鲜原生质体,先过滤再用8％的甘露醇洗涤,在含有为8％的甘露醇的BCDA液体培养基内培养2d和4d.采用新鲜原生质体、再生2d和再生4d的原生质体作材料,使用透射电镜,观察不同时期原生质体的细胞壁再生过程,并运用实时荧光定量PCR技术分析了细胞壁再生相关基因的表达.[结果]研究结果表明,原生质体培养2d后开始有微纤丝发生,在原生质体培养4d时形成细胞壁结构,细胞开始进行分裂.分析细胞壁再生相关基因的表达量,发现在新鲜原生质体中基因表达量最低,原生质体培养2d和培养4d后,基因表达量均比在新鲜原生质体中的表达量高.[结论]小立碗藓原生质体在液体培养基中培养2d微纤丝发生;原生质体培养4d形成完整的细胞壁结构.     

小立碗藓原生质体再生过程中蛋白质相互作用网络分析

[目的]探明蛋白质间的相互作用对于阐明细胞生命活动的分子机制具有重要意义.[方法]应用Cytoscape平台中MiMI插件,进行磷酸化修饰蛋白质之间的相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析.采用基于DAVID分析系统对PPI网络中的蛋白质进行Gene Ontology (GO)富集分析.[结果]有5个磷酸化蛋白质(ATX1、AGL21、KNAT2、EOL2和VIP4)与其他33个蛋白质存在相互作用关系.这些PPI网络中的蛋白质主要参与分生组织的分生状态的维持,干细胞的发育以及基因的表达调控等生物过程.[结论]小立碗藓原生质体的再生机制可能与种子植物的胚后发育相似.     

小立碗藓细胞重新编程过程中染色体重塑观察

小立碗藓(Physcomitrella patens)是研究植物发育的理想模式植物,也是目前发现的具有高频率同源重组特性的植物,其再生能力很强。此研究以生长7d的小立碗藓原丝体、培养0d的原生质体和再生2d的原生质体为材料,旨在了解小立碗藓细胞重新编程过程中染色体结构的动态变化。透射电镜观察发现原丝体染色体结构浓缩程度高;而当原丝体脱去细胞壁成原生质体状态时,异染色质开始解凝,染色体结构变得较为松散;原生质体再生2d时其染色体松散程度次之。通过进一步荧光定量PCR分析染色体重塑相关基因SWI/SNF的表达水平,发现这些基因在原生质体中表达量最高。     

ABA在小立碗藓极端干旱胁迫中的作用机制

[目的]以模式植物小立碗藓为材料,研究脱落酸(ABA)在小立碗藓极端干旱胁迫中的作用机制.[方法]将培养6d的小立碗藓用50 μmol/L ABA预处理1d后(WA),再脱水处理1 d(WAD),然后复水30min (WAR).另外一组材料是将培养7d的小立碗藓(WT,未经ABA处理)直接脱水处理1 d(WD),然后复水30 min (WR).测定6个样品(WT,WA,WAD,WAR,WD,WR)叶绿素荧光光化学淬灭系数(qP,qL)、非光化学淬灭系数(qN)和光合系统Ⅱ的实际光合效率Y(Ⅱ),分析光合作用相关基因的表达.[结果]经ABA预处理的样品脱水-复水后(WAR)其qP、qL、qN、Y(Ⅱ)值可以恢复,而未经ABA预处理的样品脱水-复水后(WR)其qP、qL、Y(Ⅱ)值均为零.进一步分析光合作用相关基因的表达,结果表明,经ABA预处理的样品脱水-复水后(WAR)的光合作用相关基因psbH、psbN和petN相对于其脱水时的表达量上调,petB和petD下降幅度较小;而未经ABA预处理的样品脱水-复水后(WR)的光合作用相关基因psbH、psbN、petN、petB和petD相对于其脱水时的表达量均下调,而且psbH、petN、petB和petD四个基因下降幅度较大.[结论]在复水过程中,ABA可以促进小立碗藓光合作用的恢复,从而提高小立碗藓的抗旱能力.     

小立碗藓细胞色素P450基因CYP73A49的克隆与功能分析

本研究克隆了一个小立碗藓（Physcomitrella patens）P450基因CYP73A49,其cDNA全长1629bp,预测编码542个氨基酸。为了进一步研究其生物学功能,利用同源重组技术对CYP73A49基因实施定点突变,成功构建了能诱导其功能缺失的载体,并获得了苔藓的功能缺失突变体。     

抑制大豆Le1基因表达的RNAi载体构建

本研究采用RT-PCR克隆大豆子粒Le1基因核心保守序列515bp片段,以植物表达载体pCAMBIA1301为基本载体,构建了抑制大豆Le1基因表达的RNAi载体。通过酶切检测及测序,证明表达载体构建正确。本研究为通过RNAi技术降低大豆中凝集素含量,改良大豆品质奠定了基础。     

银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体的构建

[目的]构建银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体。[方法]以银杏为材料,采用DNA重组技术克隆GGPPS基因质体转运肽（TP）序列,并将其与高效植物表达载体p1304＋连接形成融合表达载体（p1304＋-TP）;冻融法转化根瘤农杆菌EHA105,构建工程菌（EHA105-p1304＋-TP）。[结果]成功构建了银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体及农杆菌工程菌。[结论]为进一步研究TP转运肽的亚细胞定位奠定基础,有助于阐明银杏内酯前体生物合成关键步骤的分子机理,同时为银杏内酯的代谢工程研究提供重要依据。     

2A肽介导的割手密ScNAC1、ScDREB融合基因表达载体构建

【目的】本研究旨在构建适合甘蔗遗传转化的双基因表达载体,用于提高甘蔗栽培品种的抗旱能力,并探讨基因表达规律及互作效应。【方法】本研究以前期课题组在割手密中克隆到的具有抗旱功能ScNAC1和ScDREB为目的基因,以对单子叶植物高效、专一的Ubiquitin为启动子,以适于单子叶植物遗传转化的表达载体pCAMBIA1300-nu为基础载体,利用改造后的FMDV2A多肽进行连接,采用重叠延伸PCR(简称SOE PCR)将ScNAC1和ScDREB基因相融合,利用同源重组的方法连接表达载体。【结果】经PCR验证获得约2000 bp的目的条带,利用BamH I与Sac I双酶切,切出了载体的1条大片段和连接目的基因的3条小片段,测序结果验证扩增产物的正确性,融合基因在扩增过程中无突变发生。【结论】本研究成功构建了符合需要的融合基因表达载体,为后期甘蔗的遗传转化研究奠定了基础。     

LMW-GS16基因表达载体的构建

采用PCR方法对来自大麦的LMW-GS16基因进行修饰,在基因5′及3′端分别加入构建表达载体所需的BamHⅠ和SacⅠ限制酶切位点,并将其连接在相应酶切的质粒pBI121上,构建成LMW-GS植物表达载体pBI121-16。重组质粒转化到E.coliDH5α和农杆菌LBA4404中,通过Kanamycin筛选阳性克隆,用PCR方法进行鉴定。对照组转化率为零,转化组阳性克隆特异地扩增出900 bp片段,与目标基因DNA大小一致,转化率为1.0×106/μg DNA。     

玉米ZmPti1基因表达载体的构建及遗传转化

Pti1基因在植物的抗病信号传导中起着非常重要的作用。为了研究玉米中一个类Pti1基因ZmPti1的功能,把ZmPti1的cDNA连接到植物表达载体pGreen0029中,通过农杆菌介导转入拟南芥中进行过量表达。PCR及Western-blot分析表明,ZmPti1已经转入到拟南芥中,并且在大多数转化植株中稳定表达。通过试验,为以后对ZmPti1的生物学功能验证打下基础。     

黄瓜CsHIR1基因表达载体的构建及遗传转化

为了优化黄瓜遗传转化体系以及研究CsHIR1基因在黄瓜中的功能特性,本试验利用In-fusion技术构建植物表达载体pCAMBIA35S-CsHIR1,经过限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ双酶切检测、质粒PCR检测和测序鉴定,结果表明,表达载体pCAMBIA35S-CsHIR1已构建成功并转入农杆菌GV3101中。以黄瓜抗病种质‘PI197088’和感病种质‘CCMC’的子叶节为外植体,通过优化的农杆菌介导法初步将CsHIR1基因转入黄瓜中,经PCR检测获得25株阳性植株,其中8株阳性植株自交得到种子T1代,T1代PCR检测阳性率为44.7%,实时荧光定量分析表明CsHIR1在T1代阳性株中的相对表达量稍高于对照植株,有1株与对照组的差异较显著,这为进一步研究CsHIR1在黄瓜中的功能奠定了基础。     

水曲柳SOC1基因表达载体的构建及生物信息学分析

为研究SOC1开花调控关键节点基因在水曲柳花时调控中的作用,从水曲柳中克隆获得了SOC1的编码区全长,序列分析表明:SOC1基因长654 bp,编码218个氨基酸,与金鱼草MADS-box转录因子DEFH68基因序列相似性最高,核苷酸相似性为78%;水曲柳SOC1具有MADS-box结构域和K-结构域,同时具有DNA结合位点和磷酸化作用位点,属于MADS家族转录因子。同时利用双酶切法成功构建了水曲柳SOC1基因植物表达载体pROKⅡ-35S∶∶SOC1。     

HbDREB1基因表达载体的构建及其转基因烟草的鉴定

[目的]研究强抗寒性牧草——短芒大麦DREB1（dehydration responsive element binding protein1）基因的功能,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定理论基础。[方法]利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,对转基因烟草进行分子生物学鉴定,并对离子渗漏率、脯氨酸表达量生理生化特性进行测定。[结果]HbDREB1整合入烟草基因组,已在转录水平上表达,转基因烟草在冷胁迫条件下的离子渗漏率明显低于对照组,且其脯氨酸表达量明显增高。[结论]HbDREB1基因具有提高植物抗寒性的潜能。