脂质体瞬时转染siRNA抑制肾小管上皮细胞去乙酰化蛋白酶1的表达

建立有效的脂质体瞬时转染法,将小干扰RNA(siRNA)转染至小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs),从而抑制其乙酰化组蛋白酶1(histone deacetylases 1,HDAC1)的表达。使用阳离子脂质体法瞬时转染小鼠肾小管上皮细胞,用荧光标记siRNA(FAM-siRNA)筛选转染比例,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)确定最优条件并检测不同位点(374,525和822)HDAC1-siRNA的抑制效果,噻唑蓝(MTT)法检测不同时间点HDAC1-siRNA对RTECs增殖的影响,并设立曲古霉素处置组作为试验对照。荧光表达和Real-time PCR结果显示30 pmol siRNA∶1.5 μL Lipofectamine^TM 2000为最佳转染条件,HDAC1-374的干扰效果最明显。MTT检测结果显示,HDAC1-374与TSA一致,证实HDAC1-siRNA能有效抑制RTECs的增殖。本试验利用脂质体瞬时转染siRNA法成功抑制了RTECs中HDAC1的表达。     

Smad泛素化调节因子2siRNA的筛选及转染原代肾小管上皮细胞条件的优化简

试验旨在优化Smad泛素化调节因子2（Smurf2） siRNA最佳转染条件,筛选最佳siRNA干扰片段,进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默,为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephrohathy,AAN）中的作用奠定基础。本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells,RTECs）,并以脂质体Lipofectamine^TM 2000为转染介质,将Smurf2 siRNA转染入RTECs;通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件,转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率。CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响;同时,用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2 表达的影响。结果显示,当Lipofectamine ^TM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时,转染效率最高,为70%～80%;Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显;与正常组相比,转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件,其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2 表达的抑制率最高。     

p15基因干扰对肝癌耐药的影响

目的 探讨小于扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制p15基因对肝癌耐药的影响.方法 采用浓度递增法用顺铂(cisplatin,CDDP)诱导肝癌细胞HepG2建立动态耐药模型HepG2/CDDP/2.0.脂质体法将针对p15 mRNA的siRNA( Y1、Y2、Y3)和阴性对照siRNA-F转染至HepG2/CDDP/2.0细胞,筛选最佳转染浓度和最有效的干扰序列.MTT法检测HepG2/CDDP/2.0对CDDP的半数抑制浓度(IC50)、流式细胞仪分析HepG2/CDDP/2.0细胞周期分布、RTPCR和Western blot分别检测p15 mRNA和p15蛋白、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达.结果 成功建立肝癌耐药模型HepG2/CDDP/1.6,系中度耐药.RT-PCR显示siRNA Y3干扰效果最佳.转染后G1期细胞比例分别为53.8%(24 h),51.6% (48 h),48.8% (72 h)(P＜0.05);RT-PCR和Western blot显示p15表达降低,p-gp表达增加.结论 在肝癌耐药的动态过程中,随着耐药时间的延长,G1期的比例增加.抑制p15的表达可降低G1期的比例,增加肿瘤耐药性.     

敲低RACK1基因抑制C2C12细胞中MyoG和MHC基因表达

本实验旨在研究RNA干扰(RNAi)RACK1基因对C2C12成肌细胞中肌分化标志基因MHC和MyoG表达的影响。将人工合成的靶向RAKC1基因的3条si RNA(1,2,3)转染C2C12细胞,用RT-qPCR方法检测并筛选干扰效率最高的1条siRNA。将筛选出的si RNA转染C2C12成肌细胞并诱导细胞分化,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光方法在mRNA及蛋白水平检测RACK1基因沉默后对MHC和MyoG表达的影响。此外,Western blot方法检测RACK1基因沉默后对PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活的影响。结果表明:RACK1-si RNA-2干扰效率最高,转染48 h后抑制率可达70%。随后,C2C12细胞转染si RNA-2,诱导分化48h后RTqPCR表明,MHC和MyoG的m RNA表达均显著性下调(P<0.05);诱导分化72 h后,Western blot和免疫荧光结果表明MHC和MyoG的蛋白表达明显低于对照组,但AKT和Erk磷酸化水平未见明显变化。上述结果表明,干扰RACK1能显著抑制MHC和MyoG的表达,提示RACK1正向调控C2C12成肌细胞的分化。     

siRNA-757干扰旋毛虫Ts-ODC基因对其抗酸能力的影响

旨在探究旋毛虫肌幼虫体内是否存在鸟氨酸依赖型抗酸系统，本研究根据GenBank中Ts-ODC全序列基因组设计三条特异性siRNA分子，采用脂质体浸染转染的方法将其分别转染至旋毛虫肌幼虫体内，使用qPCR、Western blot和间接免疫荧光试验，筛选最佳干扰siRNA分子及最佳干扰条件；并在pH 1.5、2.5、4.5和6.6的条件下将肌幼虫分别培养0.5、1和2 h,从肌幼虫Ts-ODC基因转录水平、酶活性及存活率等方面分析Ts-ODC基因干扰对旋毛虫肌幼虫抗酸能力的影响；将Ts-ODC基因被干扰的旋毛虫肌幼虫感染小鼠，在7和42 d时分别收集成虫和肌幼虫，分别计算其减虫率；将子一代肌幼虫在pH 2.5的酸性条件下培养2 h,计算其存活率，对Ts-ODC基因干扰的遗传性进行分析。结果显示，Ts-ODC siRNA-757为最佳干扰分子，转染12 h、浓度为2μmol·L^-1培养3 d时为最佳干扰条件；各组pH 2.5培养2 h时Ts-ODC基因转录水平最高，pH 1.5培养2 h时虫体的存活率明显低于其他培养条件(P<0.01),pH 4.5培养0.5 ...     

牛FOXM1基因特异性siRNA干扰效率的分析

为了筛选到有效干扰牛叉头框M1(forkhead box M1,FOXM1)基因特异性siRNA,试验设计并合成3个靶向干扰牛FOXM1的5-羧基荧光素(FAM)标记siRNA,对siRNA转染剂量进行优化,筛选出干扰效果较好的siRNA,并检测干扰FOXM1后MDBK细胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达水平。结果表明:siRNA的最佳转染剂量为1.5μL(20μmol/L),3个特异性siRNA的干扰效率分别为34.2%、52.0%及72.5%,干扰牛FOXM1基因效果最好的siRNA是siRNA-929,它能够阻止细胞中LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型的转化,使自噬过程受到抑制。说明试验成功筛选到干扰牛FOXM1基因的特异性siRNA。     

GSTO1基因沉默对氟致成骨细胞自噬与凋亡的影响

为探讨氟致成骨细胞自噬和凋亡中GSTO1的作用机制,利用RNA干扰(RNAi)技术,抑制GSTO1基因在小鼠成骨细胞中表达,检测染氟小鼠成骨细胞中自噬和凋亡相关基因表达。针对小鼠成骨细胞GSTO1mRNA序列设计、合成3对21核苷酸序列siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3);从3对序列中筛选最佳有效片段,然后检测不同质量浓度氟化钠(10~4、10~3、10~2、10、1mg·L^-1)下GSTO1的mRNA转录,确定最佳氟浓度。试验分为空白对照组(control)、阴性对照组(NC-siRNA)、氟化钠组(1mg·L^-1)、沉默目的基因组(siRNA-GSTO1)和氟化钠加沉默目的基因组(NaF/siRNA-GSTO1),用RT-PCR技术检测成骨细胞自噬相关基因LC3、p62、Beclin1、Atg3、Atg5和凋亡相关基因BCL2、Caspase-3的转录,同时应用Western blot技术检测LC3、p62、Beclin1、Atg3和Atg5蛋白表达。结果显示:用HE、吉姆萨、碱性磷酸酶、茜素红四种染色法鉴定试验所用细胞为成骨细胞。确定试验模型中50nmol·L^-1为siRNA的最佳转染浓度,siRNA2为最佳沉默转染片段,NaF的最佳浓度为1mg·L^-1。成骨细胞染氟与GSTO1基因抑制均可使LC3、Beclin1、Atg5和BCL2基因转录显著升高,p62和Caspase-3基因转录显著下降;但与NaF组相比较,NaF/siRNA-GSTO1组LC3、Beclin1、和Atg5基因mRNA转录水平显著降低(P<0.05),而p62和Caspase-3基因转录显著升高(P<0.05)。Western blot检测成骨细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin1、Atg5和p62的表达与基因转录趋势完全一致。结果表明,低剂量氟与沉默GSTO1表达均可致成骨细胞自噬增强的同时凋亡减弱,GSTO1对低剂量氟致成骨细胞自噬增强与抑制凋亡有一定的协同效应。     

Myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞系的建立

旨在获得肌肉生长抑制素( Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础.针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果.结果,获得Myostatin基因沉默效率约90％的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99％的Myostatin基因沉默成纤维细胞系.采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础.     

热应激致Hsc70出入核与细胞凋亡的关系

旨在探讨热应激对H9c2心肌细胞构成型HSP70(constitutive or cognate HSPs,Hsc70)出入核及细胞凋亡的影响。以42℃作为热应激模型温度,通过转染Hsc70siRNA抑制Hsc70表达,Western blot检测细胞质和细胞核内Hsc70表达,ELISA检测细胞培养液LDH浓度,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果表明,正常H9c2心肌细胞质Hsc70表达量较高,细胞核中表达量很低,细胞质和细胞核Hsp72表达量非常低。热应激后细胞质Hsc70表达量无显著差异,而细胞核Hsc70热应激30和100min后极显著升高(P0.01),热应激240min后开始降低;细胞质和细胞核Hsp72热应激后显著升高(P0.05或P0.01)。Hsc70抑制表达后,细胞质Hsc70水平显著降低,热应激后Hsc70入核明显减少,但仍然有入核现象;Hsc70抑制表达对细胞质和细胞核Hsp72表达无显著影响。与热应激组相比,热应激+Hsc70siRNA组LDH表达量呈升高趋势,热应激100min两组出现显著差异(P0.05);Hsc70抑制表达后H9c2细胞在热应激后更容易发生凋亡,而且在热应激30和100min内,两组之间存在显著差异(P0.05)。结果提示,热应激可诱使Hsc70出入细胞核,Hsc70抑制表达后热应激诱导Hsc70入核显著降低,细胞损伤加重,细胞凋亡升高。     

靶向猪睾丸支持细胞PPP1CC基因siRNA的筛选与研究

本实验在验证PPP1CC基因在猪睾丸支持细胞ST内源性表达的基础上，针对PPP1CC mRNA靶序列设计并化学合成3段不同的siRNA序列，脂质体瞬时转染ST细胞，通过实时荧光定量PCR及Western blot检测siRNA对ST细胞中PPP1CC的干扰效率。结果显示，转染24 h后，各实验组中PPP1CC mRNA表达量均显著低于阴性对照组，其中siRNA-1效果最佳。siRNA-1转染72 h后，PPP1CC蛋白表达量显著下降。本实验成功筛选出PPP1CC基因的有效干扰序列，为后续研究提供实验依据。