藏香猪毕氏肠微孢子虫感染情况和基因分型

采集了青海省和陕西省部分地区共计450份藏香猪新鲜粪便样品,基于小亚基核糖体RNA基因(small-subunit ribosomal RNA,SSU rRNA)的巢式PCR检测样品中毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)的感染情况,并分析其遗传多样性。结果显示,218份样品感染了毕氏肠微孢子虫,总感染率为48.4%(218/450);青海省所调查藏香猪的毕氏肠微孢子虫感染率为65.8%(154/234),显著高于陕西省的感染率29.6%(64/216)(P0.001);4个年龄段间藏香猪毕氏肠微孢子虫感染率差异显著(P0.001),其中哺乳仔猪感染率最高(92.7%),而成年猪感染率最低(9.2%)。序列分析发现,藏香猪存在5个SSU rRNA基因型(Type 1～Type 5),其中Type 1为优势基因型。对218份毕氏肠微孢子虫阳性分离株的多位点序列分型发现,分别有59,26,9和99份样品在MS1、MS3、MS4和MS7基因位点成功扩增,呈现18,4,4和4种单倍型,基于MS1、MS3和MS4等3个基因位点共形成6种多位点基因型(multi-locus genotypes,MLGs)。     

长春地区梅花鹿毕氏肠微孢子虫分子流行病学调查

为了掌握长春地区梅花鹿毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)的感染率及基因型种类的分布情况,探究其在人与动物之间传播的源由,本研究于2018年12月-2019年12月期间采集长春地区8个养殖场共计538份梅花鹿粪便样品进行毕氏肠微孢子虫的流行病学调查及基因型分析,经PCR鉴定,测序分析、序列拼接比对以及系统进化分析。试验结果表明,长春地区梅花鹿毕氏肠微孢子虫的感染率为17.84%(96/538),不同养殖场的感染率为0~47.96%;研究共发现14种基因型(BEB6、EbpC、Ⅰ、JLD-Ⅲ、JLD-Ⅸ、JLD-ⅩⅤ、JLD-ⅩⅥ、JLD-ⅩⅦ、JLD-ⅩⅧ、JLD-ⅩⅨ、JLD-ⅩⅩ、JLD-ⅩⅪ、JLD-ⅩⅫ和JLD-ⅩⅩⅢ),其中BEB6为优势基因型。应用多位点序列分型(MLST)方法,选择MS1、MS3、MS4以及MS7位点对毕氏肠微孢子虫阳性样本进行多态性和群体遗传结构分析,结果显示,在96份阳性样品中,共有16份阳性分离株在至少2个位点同时扩增成功,形成10个多位点基因型(multilocus genotypes,MLGs),相同的基因型之间存在不同亚型,表明长春地区梅花鹿毕氏肠微孢子虫具有丰富的遗传多样性。本研究应用分子生物学方法对长春地区梅花鹿毕氏肠微孢子虫的流行病情况及基因型进行分析,研究结果不仅为梅花鹿毕氏肠微孢子虫防控提供科学依据,也为防控毕氏微孢子虫在人和动物间的传播提供基础数据,对保障公共卫生与健康意义重大。     

湖南省部分地区中华竹鼠毕氏肠微孢子虫基因分型研究

为了明确湖南省部分地区中华竹鼠毕氏肠微孢子虫的感染情况,从湖南省4个市的6个养殖场共采集中华竹鼠新鲜粪便样品480份,利用小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因的套式PCR对这些样品中毕氏肠微孢子虫的感染率和遗传多样性进行研究。结果发现,25份粪便样品存在毕氏肠微孢子虫感染,总感染率为5.2%,除吉首市的中华竹鼠未检出阳性外,其余各采样点及各年龄段的中华竹鼠均有毕氏肠微孢子虫感染,但感染率差异不显著(P0.05);进一步序列分析发现,所检测的中华竹鼠毕氏肠微孢子虫存在2种SSU rRNA基因型(Type 1和Type 2),其中Type 1为优势基因型;多位点序列分析发现,在MS1、MS3、MS7基因位点分别有7、1、14份样品成功扩增,呈现7、1、4个单倍型。本研究结果将为湖南省部分地区中华竹鼠微孢子虫病的防控提供基础数据。     

秦岭地区几种珍稀动物毕氏肠微孢子虫基因分型

为了评估秦岭地区珍稀野生动物的毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)的人兽共患风险,本研究采用PCR技术和多位点序列分型技术对秦岭地区5种珍稀动物毕氏肠微孢子虫的感染情况及基因型/亚型进行了分析。在采集的22份新鲜粪便中检测到7个阳性分离株,其中斑羚源5个,长颈鹿源1个,麂子源1个。基于ITS位点基因分型发现所有分离株均为人兽共患基因型,包括6个已报道的基因型D和1个尚未报道的D-new。多位点序列分型技术发现秦岭地区珍稀野生动物的毕氏肠微孢子虫存在遗传多样性,7个分离株在MS1、MS3、MS4和MS7位点分别有3、1、2、2个亚型。     

云南省怒江州部分地区独龙牛毕氏肠微孢子虫感染情况及基因分型研究

为了解云南省怒江州独龙牛毕氏肠微孢子虫感染情况,从怒江州的鸠门当、古泉村、亚左洛村、茨开镇、独龙江乡分四个季度(春、夏、秋、冬)采集独龙牛粪便样本1129份,采用分子生物学技术对其毕氏肠微孢子虫感染情况进行调查研究。结果发现,所调查地区独龙牛毕氏肠微孢子虫总感染率为1.68%(19/1129);各地点之间感染率差异显著(P<0.05),以独龙江乡感染率最高;4个季度中夏季感染率最高3.26%(9/276),春、秋和冬感染率分别为1.10%(3/272)、1.28%(4/312)和1.12%(3/269),但差异不显著(P>0.05)。序列分析发现,在19个阳性样本中成功鉴定出4种已知基因型(EbpC、BEB4、CHN3和CHN4)及2种新基因型(YNNJ1和YNNJ2),丰富了毕氏肠微孢子虫基因型数据。系统发育分析表明,所得6种基因型均为人兽共患基因型,提示怒江州独龙牛毕氏肠微孢子虫存在人兽互传的潜在风险。     

江苏和云南部分地区山羊毕氏肠微孢子虫感染情况调查

为了调查江苏省和云南省部分地区山羊毕氏肠微孢子虫的感染情况和基因型,从江苏4个地区和云南9个地区羊场采集282份山羊新鲜粪样,提取基因组DNA,采用基于毕氏肠微孢子虫核糖体内转录间隔区(ITS)序列的特异套式PCR方法进行检测,对阳性扩增产物进行克隆、测序分析,以确定其基因型。结果显示,仅在云南昆明、江苏镇江和宿迁地区的山羊粪样中检出毕氏肠微孢子虫,各地区的感染率为0～22.7%。总感染率为2.8%(8/282),江苏感染率为6.3%(6/94),云南感染率为1.1%(2/188)。不同月龄羊间感染率差异不显著(P>0.05)。阳性扩增产物经克隆、测序分析,共获得2个基因型CHG1(n=3)和CHG3(n=5),进化树分析显示2个基因型均属Group 2亚群,无人畜共患性。     

动物园动物消化道寄生虫感染情况调查

为了解动物园动物肠道寄生虫感染情况,本试验采集了来自贵阳和北京动物园33种动物,共150份粪便样品。采用饱和盐水漂浮法和离心沉淀法富集虫卵和卵囊进行显微镜检查;基于隐孢子虫、芽囊原虫、毕氏肠微孢子虫和十二指肠贾第虫的特异性基因位点对人兽共患原虫进行PCR检测和序列比对分析。结果显示,动物园动物寄生虫总感染率为64.0%。显微镜检查出的寄生虫包括毛首线虫(20.0%)、细颈线虫(2.7%)、艾美耳球虫(14.7%)和其他线虫(25.3%)。PCR检测4种肠道原虫的感染率分别为：隐孢子虫1.3%、毕氏肠微孢子虫8.7%、十二指肠贾第虫12.0%和芽囊原虫32.0%。序列比对结果显示,存在2种隐孢子虫虫种(安氏隐孢子虫和泛在隐孢子虫);7种毕氏肠微孢子虫基因型(SC02、BEB6、Type IV、PigEBITS 7、Peru8、PtEb IX和D);2种十二指肠贾第虫基因型(B和E);8种芽囊原虫基因亚型(ST1、ST2、ST3、ST5、ST8、ST10、ST13和ST14)。结果表明,贵州和北京动物园动物肠道寄生虫感染非常普遍,并且存在多种人兽共患虫种和基因型。做好动物园寄生虫病的防控不...     

云南省部分地区荷斯坦牛毕氏肠微孢子虫感染情况调查及分析

为了解毕氏肠微孢子虫在云南部分地区荷斯坦牛中的感染以及基因型分布情况，本实验从云南大理、昆明、曲靖和楚雄等牛养殖集中地区总共9个养殖场采集荷斯坦牛粪便样品547份，采用套式PCR结合测序检测并分析毕氏肠微孢子虫感染情况。结果显示，毕氏肠微孢子虫总感染率为4.57%(25/547)；各地区的感染率为0～10.53%，其中昆明地区养殖场感染率最高，不同地区间感染率差异显著(P=0.025<0.05)。断奶前犊牛感染率为6.32%(23/364)，高于其他月龄牛的感染率，但各月龄牛感染率差异不显著(P=0.052>0.05)。公牛感染率为7.84%(8/102)高于母牛3.82%(17/445)，性别间感染率差异不显著(P=0.079>0.05)。进一步通过对样品扩增产物测序分析后鉴定其基因型，结果显示本研究共鉴定出5个基因型，I、J、BEB4为3个已知的基因型和YNY1、YNY2 2个新拟定的基因型，其中BEB4为优势基因型。在不同地区中，大理检出4种基因型(BEB4、I、YNN1、YNN2)，昆明仅检出基因型BEB4，曲靖仅检出基因型J，大理地区基因型分布较为多样；在0...     

隐孢子虫不同基因型P23基因的克隆及序列比较

为克隆隐孢子虫不同基因型子孢子表面抗原P23基因,比较其序列差异,提取上海地区分离的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummouse genotype)、隐孢子虫兔基因型(Cryptosporidiumrabbit geno-type)、隐孢子虫猪基因型Ⅱ(Cryptosporidiumpig genotypeⅡ)总RNA,经RT-PCR扩增P23基因,克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,并与GenBank上下载的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)序列进行同源性比对。结果显示,从隐孢子虫3个基因型中均扩增出了P23基因。与微小隐孢子虫P23基因核苷酸序列比较,隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型ⅡP23基因同源性分别为97.6%、97.3%、97.3%,氨基酸序列同源性分别为97.3%、97.3%和96.4%。获得了隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型Ⅱ子孢子表面抗原P23基因。     

河南郑州地区奶牛源安氏隐孢子虫虫种鉴定及多位点序列分型研究

为了解河南省郑州地区奶牛隐孢子虫及安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni,C.andersoni)的亚型分布情况,本研究共采集3个奶牛场共973份奶牛新鲜粪便样品,采用显微镜检测方法进行隐孢子虫检测,对形态学鉴定的8份C.andersoni阳性样品分别基于SSU rRNA、Actin、HSP70和COWP基因位点进行虫种鉴定,基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16基因位点进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析。结果显示,隐孢子虫总感染率为2.77%(27/973),而且以断奶前犊牛感染率最高7.10%(12/169)。8份样品在不同基因位点均成功鉴定为C.andersoni分离株,并形成4个MLST亚型,其中A4、A4、A4、A1为优势亚型,A6、A4、A2、A1为新亚型,且不同亚型的卵囊大小具有显著差异。研究表明,河南省郑州地区奶牛隐孢子虫总体感染水平较低,但是对奶牛养殖业和牛奶产量仍然有较大影响,此外,C.andersoni存在多个MLST亚型,表明具有遗传多样性。     

番鸭微卫星标记的开发

为获得一批番鸭微卫星,并建立微卫星挑选标准,在番鸭中对北京鸭微卫星进行扩增,基因型用丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果显示:在33个微卫星中,有29个位点被成功扩增,6个位点具有多态,7个位点检出番鸭特有基因型,9个位点未检出多态,7个位点在北京鸭中成功扩增,但在番鸭中扩增失败。重复单元长度(Len)2 bp的微卫星扩增特异性显著优于Len≤2 bp的位点(P=0.0003),但多态检出率差异不显著(P=0.35)。重复次数(RN)≤16的微卫星多态检出率高于RN16的微卫星(P=0.27),但扩增特异性二者无明显差异(P=0.69)。在番鸭中发现的6个多态、7个番鸭特有基因型位点对基因定位、染色体装配、群体遗传学、进化生物学研究和鸭蛋的种属鉴定具有一定应用价值,并且Len2 bp、RN16的微卫星分型的准确性更高。     

2021—2022年我国部分地区猪轮状病毒分子流行病学调查

为了解我国部分地区猪场猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)的流行情况及分子特征,对2021—2022年我国部分省份的86个规模化猪场的6 472份腹泻样品进行检测,用RT-PCR方法调查PoRV的流行率,并对PoRV阳性样本进行VP7和VP4基因扩增、测序,使用MegAlign软件进行同源性分析,利用MEGA11.0构建系统进化树。结果显示,PoRV的样品阳性率为27.89%(1 805/6 472),猪场阳性率为65.12%(56/86);从98份阳性PoRV样本中扩增出76个VP7片段,G9为优势基因型(42.11%),基因型G5、G26、G3、G4、G1、G2和G11各占26.32%、9.21%、6.58%、6.58%、3.95%、2.63%和2.63%。扩增出的35个VP4基因片段,以P[13]型为主,占57.14%;其次为P[7]、P[23]、P[3]和P[6]型,分别占20%、14.29%、5.71%和2.86%。35个毒株成功鉴定出G/P基因型,G9P[13](28.57%)为优势组合基因型,其他基因型为G5P[13](11.43%)、G4P[13...     

近交系基因敲除小鼠微卫星不稳定性分析

前期研究中选取了198个与基因突变和疾病相关的小鼠微卫星不稳定性位点,经对转基因和基因突变小鼠研究,发现有41个位点具有不稳定性.为了进一步确认这些位点与基因改变的相关性,本试验应用这41个微卫星位点对29种C57BL/6J基因敲除小鼠进行了检测,并将野生型C57BL/6J和129品系小鼠(ES供体)作为对照.通过PCR扩增,STR扫描和直接测序的方法检测微卫星的不稳定性.在41个微卫星位点中有10个位点在11种基因敲除小鼠中呈现不稳定性(24.4％,10/41).核心序列为三核苷酸的D3Mit22在9号基因敲除小鼠中显示不稳定性,其余40个位点的核心序列均为二核苷酸,有9个位点呈现不稳定性(22.5％,9/40);另一方面,29种基因敲除小鼠有11种出现了不稳定性(37.9％,11/29);(TG)n为核心序列的二核苷酸表现不稳定性的比率最大(50％,2/4),依次为(GT)n(27.27％,3/11)和(AG)n(25％,1/4),重复序列(CA)n、(CT)n分别为23.08％(3/13)和20％(1/5).克隆测序的结果显示,6种基因敲除小鼠呈现核心序列片段的插入,1种基因敲除小鼠则为缺失.有2个位点(D13Mit3和D14Mit102)在2种基因敲除小鼠中出现不稳定性,9号基因敲除小鼠在2个位点(D3Mit22和D13Mit3)呈现不稳定性.结果显示基因敲除小鼠出现了微卫星不稳定性.     

内蒙古某奶牛场两种致犊牛腹泻原虫的鉴定及遗传进化分析

为明确内蒙古某规模化奶牛养殖场腹泻犊牛寄生虫性病原的感染情况及其分子学特性,采集该养殖场18头发生腹泻犊牛的新鲜粪便样品。通过形态学方法并结合分子生物学方法对样品中隐孢子虫(Cryptosporidium)和蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)进行分离鉴定和感染情况统计分析。形态学检查结果表明,18份粪便样品中隐孢子虫感染率为5.56%(1/18),蓝氏贾第虫感染率为72.22%(13/18)。进一步对18份粪便样品提取DNA,并基于SSU rRNA和BG基因位点分别对隐孢子虫和蓝氏贾第虫进行PCR扩增、序列比对和遗传进化分析。电泳检测结果显示,显微镜检测阳性粪便样品均在830 bp和511 bp处出现目的扩增条带。同时,序列比对及遗传进化分析也表明,所分离到的隐孢子虫与来自于不同国家和地区的牛隐孢子虫(C.bovis)在SSU rRNA基因位点上具有100%序列同源性,因此被归于同一个进化分支,而所分离的蓝氏贾第虫在BG基因位点上与集聚体E参考分离株的序列同源性高达99.78%以上,提示其属于集聚体E。通过形态学和分子学方法明确了牛隐孢子虫和蓝氏贾第虫是该奶牛场主要致犊牛腹泻...     

保定地区奶牛源隐孢子虫的分离与基因鉴定

为了解保定地区奶牛源隐孢子虫感染情况,从当地3个奶牛场随机采集145份奶牛粪便经饱和蔗糖溶液漂浮后直接镜检和抗酸染色后镜检,阳性样品采用PCR方法扩增18S rRNA基因,同时将扩增出的目的片段进行克隆和序列分析,并将分离株与其他11个隐孢子虫参考株的18S rRNA序列进行比对和遗传距离比较。结果表明:有10份粪便样本为隐孢子虫阳性,感染率为6.9%(10/145),不同奶牛场、年龄段奶牛隐孢子虫感染率有显著性差异(P0.05)。10份粪便样品采用PCR方法扩增后有7份为18S rRNA基因阳性,扩增出的18S rRNA部分基因片段长528 bp。保定地区隐孢子虫分离株扩增的基因序列与牛源隐孢子虫18S rRNA基因序列(Gen Bank登录号为HQ179571)同源性最高,确定保定地区分离到的奶牛源隐孢子虫为牛隐孢子虫。     

柯坪县规模化养殖场双峰驼隐孢子虫感染情况调查与种类鉴定

[目的]掌握新疆维吾尔自治区阿克苏地区柯坪县规模化养殖场双峰驼隐孢子虫的感染情况和种类分布情况。[方法]从柯坪县4个乡(镇)6个规模化双峰驼养殖场共收集516份粪便样本,全部提取DNA样本,基于隐孢子虫(Cryptosporidium)SSU rDNA序列进行PCR检测,序列比对分析后进行隐孢子虫种类鉴定;采用χ²检验法比较不同规模化养殖场双峰驼隐孢子虫的感染率差异;将被鉴定为微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C. parvum)阳性的DNA样本,基于gp60基因序列进行PCR检测,序列比对分析后进行微小隐孢子虫亚型鉴定。[结果]516份双峰驼粪便DNA样本中检测出34份隐孢子虫阳性,总体感染率为6.59%(34/516),以阿恰勒镇养殖场2的双峰驼隐孢子虫感染率最高,为9.57%(9/94);不同养殖场双峰驼隐孢子虫的感染率统计学差异显著(χ²=5.497,P<0.05)。基于SSU rDNA序列,34条隐孢子虫序列经比对分析,鉴定出3种隐孢子虫,分别为安氏隐孢子虫(n=29)、隐孢子虫大鼠基因型Ⅳ(n=1)...     

山东省滕州市羊隐孢子虫感染检测与其actin序列分析

为了解山东省滕州市羊隐孢子虫感染情况和种类,从该市2个绵羊场、2个山羊场采集222份羊粪便样品,提取所有样品的基因组DNA,采用巢式PCR扩增隐孢子虫actin基因,对阳性样品进行序列测定和分析。结果显示,滕州市羊隐孢子虫总的感染率为6.76%,其中绵羊7.84%,山羊5.83%;不同月龄的羊感染情况不同,6~12月龄绵羊感染率最高(20.69%),而12月龄以上的山羊感染率最高(10.00%);共发现3种隐孢子虫感染,其中微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.parvum)检出率最高为53.33%,其次是肖氏隐孢子虫(C.xiaoi)为40.00%,仅发现1例(6.67%)泛在隐孢子虫(C.ubiquitum)感染;序列比对结果显示,本试验所获得基因序列与Gen Bank中的C.parvum、C.xiaoi、C.ubiquitum actin基因序列同源性达到100%;系统进化分析显示,滕州市的羊样品中鉴定的actin序列,与Gen Bank中的相应虫种序列在同一分支上。研究结果为深入了解滕州市羊隐孢子虫流行情况及制定有效的防控措施提供了依据。     

应用生物素标记和蛋白质组学方法分离鉴定柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)的表面蛋白

建立灵敏、特异、稳定的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)表面蛋白分离鉴定技术,对研究其侵染机制和早期检测技术非常重要。采用生物素Sulfo-NHS-SS-biotin能特异性标记柞蚕微孢子虫的表面蛋白;经生物素标记后的微孢子虫用0.01 mol/L NaOH和2%SDS的混合液裂解结合超声波破碎的方法能提取到更多的微孢子虫总蛋白质;用30%乙腈和70%甲酸配合沸水浴处理可有效洗脱微孢子虫表面蛋白。对得到的柞蚕微孢子虫表面蛋白检测样品进行LC-MS/MS质谱鉴定,共获得了8个假定的表面蛋白,其中分子质量为26.6 k D(Np SWP12)、25.7 k D(Np SWP26)、32.0 kD(Np SWP30)的3个假定蛋白经间接免疫荧光分析确证为定位在孢子表面的蛋白质。序列分析显示,NpSWP12、NpSWP26、NpSWP30与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白NbSWP12、NbSWP26、NbSWP30的氨基酸序列相似度分别为100%、93%、79%,其中Np SWP26无N-糖基化位点和O-糖基化位点,但C端具有介导孢子粘附宿主细胞的肝素结合基序。分离鉴定的3个表面蛋白可以作为柞蚕微孢子虫侵染机制研究和早期检测的靶标蛋白。     

新疆南疆某规模化绵羊养殖场腹泻羔羊隐孢子虫感染情况及其分子鉴定

[目的]了解新疆南疆某规模化绵羊养殖场腹泻羔羊隐孢子虫感染情况和基因亚型分布特点。[方法]采集新疆维吾尔自治区某规模化绵羊养殖场4个品种1月龄以内腹泻羔羊新鲜粪便样本60份,使用饱和蔗糖溶液漂浮法检查隐孢子虫卵囊,进行种类初步鉴定;全部粪便样本提取基因组DNA后,基于隐孢子虫SSU rRNA基因位点和微小隐孢子虫gp60基因位点,对其进行PCR扩增、测序和序列分析,鉴定隐孢子虫种属和基因亚型,构建遗传进化树解析其分子遗传特征。[结果]经显微镜观察,发现38份样本呈隐孢子虫卵囊阳性,形态学初步鉴定为微小隐孢子虫;基于SSU rRNA基因位点,采用PCR方法检测出52份样本呈隐孢子虫阳性,感染率为86.67%(52/60),经序列比对分析,均为微小隐孢子虫;基于微小隐孢子虫gp60基因位点,PCR扩增后成功获得49条序列,经比对分析均为ⅡdA19G1基因亚型。[结论]该养殖场腹泻羔羊普遍感染微小隐孢子虫,其基因亚型均为ⅡdA19G1。调查结果为新疆南疆绵羊隐孢子虫种属鉴定与遗传进化研究提供了基础数据。     

腹泻犊牛感染的隐孢子虫种类鉴定及基因分型

为了鉴定陕西省某牛场有腹泻症状犊牛感染的隐孢子虫(Cryptosporidium)种类及其分子生物学特征,基于隐孢子虫18SrRNA和GP60基因位点,对从该场采集到的3例腹泻犊牛新鲜粪便样品进行PCR扩增和序列分析。结果表明,3份样品全部为Ⅱd型微小隐孢子虫(C. parvum),其中2份为ⅡdA30G4,1份为Ⅱd A34G4。说明在该牛场中的腹泻犊牛存在微小隐孢子虫感染,需引起养殖者的重视。