从江香猪ApoA1基因的克隆及亚细胞定位研究

试验旨在克隆从江香猪载脂蛋白A1（apolipoprotein A1,ApoA1）基因,研究ApoA1基因在真核细胞中的亚细胞定位情况。通过提取从江香猪总RNA,采用RT-PCR、目的基因的连接、转化等方法构建携带有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-ApoA1重组质粒,并经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确后,转染HEK-293T细胞,36 h后观察荧光,分析ApoA1蛋白在真核细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,从江香猪ApoA1基因与GenBank上公布的野猪序列相比,有6处发生了碱基突变,其中5处为有义突变,分别导致180位氨基酸由丙氨酸变为谷氨酸、185位氨基酸由组氨酸变为谷氨酰胺、186位氨基酸由缬氨酸变为亮氨酰胺、209位氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸;PSORT Ⅱ Prediction和荧光共定位试验结果均表明,ApoA1蛋白的表达主要集中在细胞外基质,约占总表达量的77.8%。本试验成功克隆了从江香猪ApoA1基因CDS区,且ApoA1蛋白的表达主要集中在细胞外基质中,为进一步构建ApoA1基因转基因动物模型、开展ApoA1基因与人类因肥胖引起的相关疾病关系的研究奠定基础。     

从江香猪miR-143-3P克隆及组织表达

为探究miR-143-3P对从江香猪的表达调控作用,本研究通过SWChen 2.3程序筛选出PRKAA1基因3'-UTR相关的miRNAs,利用生物信息学软件分析其保守性,采用茎环法设计引物克隆miR-143-3P序列,运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测该miRNA在从江香猪各组织中的表达水平.结果表明:...     

从江香猪SIM1基因SNPs筛查及生物信息学分析

本研究以从江香猪为研究对象,二元杂交猪(从江香猪×野猪)、外三元杂交猪(杜×长×大)为对照,采用DNA池和直接测序技术对3个群体的SIM1基因7个外显子、部分内含子以及3'非翻译区序列进行多态性检测;利用生物信息学软件预测多态位点对SIM1基因mRNA二级结构和蛋白质一级、二级结构的影响。结果表明,在3个群体的SIM1基因中筛查到12个SNPs,C77T位于第5外显子,T29186C、A29195C位于第9内含子,C63T、C225T位于第10外显子,C107T、A426G、T583C、A586C、A605C、A615C位于第11外显子,G267T位于3'非翻译区。其中C77T、T29186C、A29195C、C63T、C225T、C107T、G267T为同义突变,A426G、T583C、A586C、A605C、A615C为错义突变;5个错义突变分别导致异亮氨酸(Ile)变为缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)变为脯氨酸(Pro)、谷氨酸(Glu)变为丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)变为天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)变为组氨酸(His);根据在线软件预测,突变前后的SIM1基因mRNA二级结构和蛋白质一级、二级结构均会发生改变。     

高产从江香猪资源调查及其FSH基因型分析

对贵州省从江县养殖的从江香猪资源进行了全面的调查,发现当地存在特殊的高产从江香猪群体。对同龄的高、低产香猪的体尺进行对比,同时采用PCR分析2个群体的促卵泡激素β亚基(follicle stimulating hormone,FSHβ)的基因型,结果表明,高产从江香猪群体的产仔数明显高于低产群体,同时,从江香猪高产群体的体长、体重、胸围、腰围4项指标明显较高(P<0.05),纯合的AA基因型频率也较高。结果表明:高产从江香猪不仅产仔数多,同时生长速度较快,基因更为纯合。从江香猪高产群体的深入研究将为香猪资源的多方位开发利用奠定基础。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

从江香猪CAST基因的组织时序表达规律分析

为探究钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因在从江香猪组织中的时序表达规律,实验采用实时荧光定量PCR技术检测1、3、6、9、12月龄从江香猪心肌、肝脏、骨骼肌、背最长肌和脂肪5个组织中CAST基因mRNA的表达情况,并采用RT-PCR方法对贵州从江香猪CAST编码区基因进行克隆.结果表明:CAST基因在不同年龄阶段从江香猪...     

贵州从江香猪PDK4、FGF10基因的克隆及组织表达分析

试验旨在克隆获得PDK4、FGF10基因,并研究大白猪与从江香猪不同组织中PDK4、FGF10基因mRNA的表达差异。采用RT-PCR分别克隆从江香猪PDK4、FGF10基因并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术检测PDK4、FGF10基因在大白猪和从江香猪不同组织中mRNA的相对表达量。结果显示,从江香猪PDK4基因的编码区全长1 224 bp,编码407个氨基酸;FGF10基因的编码区全长636 bp,编码211个氨基酸。经BLAST软件进行同源性比对,发现从江香猪PDK4基因与羊、马、人的核苷酸序列同源性分别为93%、92%和91%;FGF10基因与羊、牛、人、鼠的核苷酸序列同源性分别为94%、93%、93%和90%。由PDK4基因系统进化树可知,从江香猪与牛、绵羊亲缘关系较近;由FGF10基因系统进化树可知,从江香猪与绵羊、牛、人、猕猴亲缘关系较近,与小鼠和鸡亲缘关系较远。实时荧光定量PCR结果显示,在从江香猪不同组织中,PDK4基因在肾脏中的表达量最高,在胃和脂肪中表达量较高,FGF10基因在胃中表达量最高,在肾脏和脂肪中表达量较高,两个基因在背最长肌中的表达量均最低;在大白猪的不同组织中,PDK4、FGF10基因在脂肪中的表达量均最高,PDK4基因在背最长肌中的表达量最低,而FGF10基因在心脏中表达量最低。本试验成功克隆了从江香猪PDK4、FGF10基因,并检测了其在大白猪与从江香猪不同组织中的表达,为进一步研究PDK4、FGF10基因在脂质代谢及脂肪沉积等方面的调控作用提供科学依据。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素（interferon-beta,IFN-β）基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋（77.42%）和无规则卷曲（17.74%）为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%,与禽的同源性最低（35.2%）;从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

从江香猪抑制素α基因克隆及其卵巢表达研究

为了探索抑制素α基因(inhibin-α,INHA)与从江香猪繁殖性状之间的相关性,试验采用特异性聚合酶链式反应(PCR)技术克隆从江香猪INHA基因,测定其核苷酸序列,通过等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)方法检测从江香猪低产群与高产群之间INHA基因的多态性变化,以实时荧光定量PCR技术检测高产、低产从江香猪卵巢组织中INHA基因的表达量。结果表明,从从江香猪基因组中成功克隆了INHA基因,编码区完整,全长1095 bp,编码364个氨基酸;经比对发现, INHA基因外显子2序列中存在2个候选SNPs位点(G359A和A373G)。经大样本检测,从江香猪高产群与低产群之间2个候选SNPs位点的基因频率没有明显差异;相比之下,高产从江香猪卵巢中INHA基因的表达量较高。研究结果提示,从江香猪INHA基因结构保守,可能主要通过基因的表达量变化调节从江香猪卵巢的生长和卵泡的发育。     

促进从江香猪生产发展的技术措施及对策

香猪是我县的特色地方品种,它以其“体型矮小,肉质细嫩,基因纯合,纯净无污染”等特点而闻名全国,自1998年以来,为了发挥香猪品种资源优势,县委、县政府结合县情实际,把发展香猪生产作为农村脱贫致富的一项支柱产业来抓,在国家、省、地县的关心和重视下,先后投入600多万元,建成面积达600m2,年屠宰50万头猪的现代化加工生产线和贮存200t的冷库一座,组建香猪开发公司,研制出腊香猪、烤香猪、香猪香肠、香猪火腿,香猪腊肉、美味心肝等系列风味食品,在香猪     

Cloning and Subcellular Localization of ApoA1 Gene in Congjiang Xiang Pig

This experiment was aimed to clone apolipoprotein A1(ApoA1) gene of Congjiang Xiang pig, and study the subcelluar localiztion of ApoA1 gene in eukaryocyte. The recombination plasmid pEGFP-C1-ApoA1 was constructed with RT-PCR and other methods, and detected by colony PCR,double digestion and sequencing, after successful construction of the recombination plasmid pEGFP-C1-ApoA1,the subcellular localization of ApoA1 protein were analyzed by fluorescence co-localization technique in the 36 h-transfected HEK-293T cells. Compared with ApoA1 gene of Sus scrofa submission in GenBank, the results showed that six base mutations were found in ApoA1 gene of Congjiang Xiang pig, five of above mentioned mutations were sense mutations, causing alanine to glutamic acid, histidine to glutamine, valine to leucine and aspartic acid to glycine in 180,185,186 and 209 amino acid residues, respectively. Using PSOR Ⅱ Prediction and fluorescence co-localization, it was found that the expression of ApoA1 protein was observed mainly in the extracellular matrix (77.8%). In conclusion, ApoA1 gene of Congjiang Xiang pig was cloned successfully, and the expression of ApoA1 protein was mainly concentrated in the extracellular matrix. These results would provide a knowledge for further constructing the ApoA1 gene transgenic animal models, and contribute to understanding the relation between ApoA1 gene and the human obesity-induced diseases.     

从江香猪γ干扰素基因克隆与序列分析

试验旨在研究从江香猪γ干扰素（interferon gamma,IFN-γ）基因克隆与序列分析。试验提取贵州从江香猪肝脏组织总RNA,反转录生成cDNA,采用2对特异性引物进行巢式PCR扩增从江香猪IFN-γ（CJ-poIFN-γ）基因编码区,将其克隆至pUCm-T载体上,获得重组质粒pUCm-CJpoIFN-γ,并测序鉴定;利用NCBI、SOPMA、SignalP-4.1等在线服务器软件、DNAStar软件对CJ-poIFN-γ进行序列分析。结果表明,CJ-poIFN-γ基因编码区长501 bp,编码166个氨基酸;核苷酸序列比对结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪、荣昌猪、印度猪、长白猪、内江猪同源性为99.4%~100.0%;进化树分析结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪亲缘关系较近;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白不存在跨膜结构,为分泌蛋白,前23个氨基酸为信号肽序列;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白二级结构主要以α-螺旋（50.60%）和无规则卷曲（33.14%）为主,B细胞表位主要位于62-65、84-87、113-115、144-156和162-166位氨基酸。试验结果为进一步研究IFN-γ的生物活性、加快从江香猪品种资源的有效利用奠定基础。     

Cloning and Tissue Expression Analysis of PDK4 and FGF10 Genes in Guizhou Congjiang Xiang Pig

The objective of this study was to clone PDK4 and FGF10 genes, and investigate the expression level of PDK4 and FGF10 genes mRNA in different tissues of Large White pig and Congjiang Xiang pig. The PDK4 and FGF10 genes were cloned by RT-PCR and analyzed by bioinformatics, the relative expression of PDK4 and FGF10 genes were detected by Real-time PCR. The results showed that the coding region of PDK4 gene was 1 224 bp, encoding 407 amino acids; The coding region of FGF10 gene was 636 bp and encoded 211 amino acids. The homologies of nucleotide sequences of PDK4 gene with sheep, horse and human were 93%, 92% and 91%,respectively. The homologies of nucleotide sequences of FGF10 gene with sheep, cattle, human and mouse were 94%,93%, 93% and 90%, respectively. The phylogenetic tree of PDK4 gene showed that the genetic relationship of Congjiang Xiang pig, cattle and sheep were very close, the phylogenetic tree of FGF10 gene indicated that the genetic relationship of Congjiang Xiang pig, cattle, sheep, human and macaque were very close, but the genetic relationship of Congjiang Xiang pig, rat and chicken were far away. Real-time PCR results showed that, in different tissues of Congjiang Xiang pig,PDK4 gene expression in kidney tissue was higher than other tissues, with a higher expression in stomach and adipose as well,FGF10 gene expression in stomach tissue was higher than other tissues, with a higher expression in kidney and adipose as well, but both of PDK4 and FGF10 genes expression were the lowest in longissimus dorsi. In different tissues of Large White pig, both of PDK4 and FGF10 genes were expressed the highest in adipose than other tissues, PDK4 gene expression in longissimus dorsi was the lowest, while the FGF10 gene expression the lowest in heart. This study successfully cloned the PDK4 and FGF10 genes of Large White pig and Congjiang Xiang pig,and detected the relative expression of PDK4 and FGF10 genes in different tissues of Large White pig and Congjiang Xiang pig, and also provided scientific basis for further study on regulation of PDK4 and FGF10 genes on lipid metabolism and deposition.     

从江香猪生精上皮周期及睾丸发育的形态学分析

试验旨在探究初情期前后生精上皮周期差异及睾丸发育过程中的形态学变化。通过测定15、30、60和90 d睾丸相关指数,结合睾丸组织形态学特征,判断香猪初情期,划分从江香猪生精上皮周期。结果显示,30 d的睾丸指数较15 d极显著升高（P<0.01）,睾丸重、长轴及短轴的增长率分别为298.05%、66.42%和65.45%,60和90 d两个阶段睾丸重增长率相对稳定。形态学观察表明,从江香猪30 d时生精小管出现游离精子,完成第一次生精并进入初情期;与15 d相比,30 d生精小管面积和生精上皮厚度极显著增加（P<0.01）,增长率分别为136.12%和40.19%,在60和90 d均处于稳定增长状态。睾丸细胞数统计显示,日龄增加不影响支持细胞（setoli cells,SC）数量（P>0.05）,而30 d生殖细胞数（germ cells,GC）较15 d极显著增加（P<0.01）。相关分析结果发现,生殖细胞数量增加与生精小管面积增大、生精上皮厚度变化之间呈明显正相关（r=0.994;0.96）。根据生殖细胞组合形式差异,将初情期前后生精上皮分为3和8个阶段。初情期前生殖细胞以第一次减数分裂前期为主,A、B型精原细胞、SC、初级精母细胞（primary spermatocyte,Ps）、前细线期（preleptotene,PI）、细线期（leptotene,L）等生殖细胞在初情期前后生精上皮中均存在,而圆形精子（round spermatids,R）、延伸精子（elongating spermatid,E）、精子细胞（spermatozoa,S）仅存在于初情期后的生精上皮。本研究结果表明,从江香猪30 d初情,睾丸发育以生殖细胞和生精小管面积的迅速增加为主,该结果对从江香猪早熟性状挖掘、种猪选育及开发利用等有重要的指导意义。     

从江香猪基因组中2个拷贝数变异区的多态性研究

为了研究从江香猪生长和繁殖差异与拷贝数变异拷贝数变异(copy number variation,CVN)之间的关系,采用实时荧光定量PCR方法,对从江香猪和大白猪基因组中的CNVR100与CNVR373的拷贝数进行了测定,并分析了从江香猪拷贝数与生长繁育性状之间的相关性。结果表明,从江香猪和大白猪基因组中都检测到CNVR100和CNVR373;与大白猪相比,从江香猪的CNVR100拷贝数较低,CNVR373拷贝数较高;相关性分析结果显示,从江香猪2个CNVRs与其体长和胸围有一定的负相关关系,表明这2个CNVRs的多态性可能对从江香猪的生长有一定的影响。     

从江香猪基因组甲基化修饰与体重之间的相关性研究

为了探索从江香猪生长慢的表观遗传学机理,本试验应用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplifying polymorphism,MSAP)技术,将60头20 d从江香猪分为高体重组和低体重组,研究血液和肝脏基因组DNA中胞嘧啶的甲基化程度,并测定差异的甲基化片段核苷酸序列.结果发现,MSAP分析得到5 977条带;与低体重组相比,高体重组的血液和肝脏总甲基化水平较低,两组的血液半甲基化水平均较肝脏中的高,全/总甲基化水平较低.提示香猪血液和肝脏基因组的总甲基化程度随体重的增加而下降.经克隆测序得到5条有差异的甲基化条带A1-A5,其中A1和A2源自血液,A3-A5来自肝脏;A1和A4片段为高体重组特有,其余3条片段为低体重组特有;A3片段未找到相关基因,其他4个片段处于代谢或免疫相关的基因内部或5'侧翼区.提示从江香猪基因组的甲基化水平存在个体差异,并与20 d体重相关;得到的4条甲基化片段,将有助于香猪甲基化调控机制的研究.