抑制PERK对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬的影响

旨在研究PERK在脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬中的作用。首先,试验设对照组(CON)和LPS组(LPS,4μg·mL^-1),研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞内质网应激和自噬的影响;随后用不同浓度的PERK抑制剂GSK2606414(GSK)预处理细胞,通过测定PERK、ATF4、eIF-2α和CHOP的mRNA表达,筛选出GSK的最佳抑制浓度;最后将奶牛乳腺上皮细胞分为对照组(CON)、LPS组(LPS)、GSK+LPS组(GLPS)和GSK组4组,研究抑制PERK对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬的影响。采用RT-qPCR和Western blot分析内质网应激、自噬相关基因和蛋白的表达,通过免疫荧光检测GRP78和p62的荧光强度。结果表明：1)与对照组相比,LPS组的PERK、IRE1α、ATF6、GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高。LPS还可以显著升高LC3、ATG5、ATG14和Beclin1的mRNA和蛋白表达(P<0.01),并且显著降低p62的mRNA和蛋白表达(P...     

基于WIPI1蛋白自噬检测方法及其在PCV2感染细胞自噬研究中的应用

多种病毒感染能够诱导细胞自噬,WIPI1蛋白是一种新发现的细胞自噬标记分子。为在PK-15细胞中建立基于红色荧光蛋白(Ds Red)与WIPI1融合表达蛋白的自噬检测方法,本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)感染为模式病毒,以药物处理作为阳性对照验证该方法的适用性。采用亚克隆策略构建了表达猪源WIPI1与Ds Red融合蛋白的真核重组表达质粒p Red-WIPI1,western blot检测显示Ds Red-WIPI1融合蛋白能够在PK-15细胞内表达,但不激活自噬标志分子LC3-II形成。然而,激光共聚焦分析显示,PCV2感染或自噬诱导剂Thapsigargin(Tg)及饥饿处理均能够显著促进WIPI1在细胞内形成点状聚集,并且促进Ds Red-WIPI1与EGFP-LC3的共定位。此外,荧光定量PCR结果显示,PCV2感染或Tg处理均能够显著上调wipi1的m RNA水平。本研究在稳定表达EGFP-LC3的PK-15细胞中建立了基于WIPI1蛋白的细胞自噬检测方法,该方法可以用于深入探索相关病毒感染诱导细胞自噬及其机制。     

Toll样受体2(TLR2)参与猪链球菌诱导的自噬作用

为证实Toll样受体2(TLR2)是否参与2型猪链球菌诱导的细胞自噬作用,通过阻断TLR2,并建立2型猪链球菌感染J774A.1细胞模型,分别应用荧光定量PCR分析不同处理组细胞TLR2和NF-κB mRNA水平、ELISA检测细胞上清中TNF α和IL-6含量变化以及Western blot检测细胞内LC3蛋白的表达量.结果显示,TLR2和NF-κBmRNA水平在感染后3h明显高于对照组；与对照组相比,感染组TNF-α含量及LC3Ⅱ表达均明显升高(P＜0.01)；与感染组相比,阻断TLR2后TNF-α含量及LC3Ⅱ表达均明显降低(P＜0.05).结果表明,2型猪链球菌可激活TLR2及其信号通路,并且该通路的活性影响细胞自噬作用.     

猪Beclin1基因调控伪狂犬病病毒诱导细胞自噬和凋亡的机制分析

旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)感染后细胞自噬和凋亡情况,进一步分析鉴定PRV感染条件下与Beclin1互作的猪宿主凋亡家族蛋白。利用免疫印迹(WB)方法检测PRV感染细胞的自噬水平;利用流式细胞术探讨凋亡水平;最后利用免疫共沉淀试验分析PRV感染PK-15细胞中Beclin1与Bcl-2和Bcl-xL的结合水平。结果显示,PRV感染导致LC3-Ⅱ的表达明显增多,而P62显著下降,且AKT(S473)磷酸化水平显著减少;其次,PRV感染诱导细胞凋亡且显著上调剪切型Caspase-9/8的表达水平;最后,免疫共沉淀结果显示PRV感染条件下Beclin1能与Bcl-2和Bcl-xL结合,但结合的水平明显降低。PRV感染诱导的细胞自噬可能依赖于PI3K-Ⅰ/AKT信号通路,PRV感染可能同时激活了线粒体凋亡途经和死亡受体途经从而诱导细胞凋亡,而PRV感染诱导的细胞自噬和细胞凋亡可能通过抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL结合而相互关联。     

敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sg RNA,构建重组载体p UC19-RIG-I-sg RNA1和p UC19-RIG-I-sg RNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子m RNA水平,IPMA方法及Taq Man定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的m RNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。     

脂肪分化相关蛋白2对BCG诱导小鼠传代巨噬细胞自噬的调控作用

本研究旨在探讨脂肪分化相关蛋白2(perilipin 2,PLIN2)在卡介苗(bacillus calmette-guérin, BCG)感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7中对自噬的调控作用。利用小干扰RNA敲减小鼠巨噬细胞RAW264.7中PLIN2的表达，结合BCG感染，通过免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光等技术，检测胞内PLIN2、自噬、内质网应激及脂肪酸代谢相关因子指标的表达变化。结果显示：BCG感染显著上调巨噬细胞RAW264.7中PLIN2的表达(P<0.05),极显著上调自噬相关蛋白ATG5(P<0.01)、ATG12(P<0.001)及LC3(P<0.001)的表达，并伴随着细胞内中性脂质的蓄积。敲减PLIN2能使BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中自噬相关蛋白ATG5(P<0.05)和ATG12(P<0.05)显著下调以及LC3(P<0.001)极显著下调，细胞自噬率极显著降低(P<0.001),并极显著降低细胞内中性脂质的含量(P<0.001)。同时，敲减PLIN2显著下调CHOP(P<0.05),并极显...     

Wnt5a介导Wnt/Ca2+通路对BCG诱导牛原代肺泡上皮细胞自噬的调控作用

旨在探讨体外分离培养牛肺泡上皮细胞（bovine alveolar epithelial cells,BAECs）的方法及Wnt5a对牛结核分枝杆菌卡介苗（bacille Calmette-Guérin,BCG）感染BAECs细胞自噬的调控机制。试验选用酶联合消化法和机械刮刷法分离细胞,差速贴壁法纯化BAECs,免疫荧光染色检测上皮细胞标志物角蛋白14（cytokeratin 14,CK14）和角蛋白5（cytokeratin 5,CK5）的表达;BCG感染BAECs,并用Box-5抑制Wnt5a的表达,Western blot和免疫荧光染色检测自噬相关蛋白及非经典Wnt信号通路相关蛋白的表达。结果表明,采用酶联合消化法和机械刮刷法能够成功分离纯度较高的BAECs,细胞经CK14和CK5鉴定为阳性;BCG感染BAECs促进Wnt5a表达,增加细胞自噬,Box-5预处理下调BCG诱导的细胞自噬相关蛋白LC3II、P62、Atg7及Atg5的表达,且抑制非经典Wnt/Ca²⁺信号通路相关蛋白Wnt5a、CaMKII及NFAT的表达。综上,试验成功建立BAECs分离培养方法,BCG感染增加BAECs内Wnt5a表达和细胞自噬,抑制Wnt5a下调BCG诱导的BAECs细胞自噬,且Wnt5a是通过非经典Wnt/Ca²⁺信号通路调控BCG诱导的BAECs细胞自噬。     

黄芩苷对自噬介导H6N6禽流感病毒致病损伤的作用

探究黄芩苷对H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏致病损伤的作用。选用40只昆明小鼠随机分为4组，即对照组、模型组、黄芩苷治疗组、3-MA抑制剂组。通过HE染色观察肺组织病理形态学变化，ELISA法检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α的含量，透射电镜检测小鼠肺脏中自噬体的水平，Western blot检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG7蛋白表达水平，免疫荧光法检测肺组织LC3蛋白表达水平，免疫组化法检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG5蛋白表达水平，RT-qPCR检测肺组织自噬关键基因LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平。结果显示，经黄芩苷治疗后能显著缓解H6N6亚型禽流感病毒对小鼠肺组织的损伤，血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α含量显著下降(P<0.01),肺组织中自噬体数量减少，LC3、Beclin-1、ATG5及ATG7蛋白表达水平显著下降(P<0.01),肺组织中LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平显著下降(P<0.01)。结...     

猪圆环病毒2型感染PK-15细胞中外泌体的鉴定及其对细胞增殖和凋亡的影响

旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子(CD81、TSG101);PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30～200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显(P0.01),外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖(P0.01或P0.05);PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。     

PCV2感染后JAK-STAT信号通路的基因差异表达分析

JAK-STAT信号通路是阐明细胞因子生物学功能及病毒如何发挥作用的分子基础，但对于猪圆环病毒2型（PCV2）感染及病毒复制的作用机制，目前尚无报道。本研究采用PCR列阵方法，建立PK-15细胞JAK-STAT信号通路的功能分类芯片，分析JAK-STAT信号通路中所有已知的Jak和Stat家族成员、激活JAK-STAT信号通路的受体，以及与Stat蛋白相关的核辅助因子及共同活化因子、Stat诱导蛋白及该通路的负反馈调节蛋白等基因在PCV2感染后的差异表达情况，为进一步明确PK-15细胞JAK-STAT信号通路对病毒复制力和复制机制奠定基础。     

PEDV感染过程中TRIM5α介导的自噬对病毒复制的影响

旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru, PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达，明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段，将其转染至Vero-E6细胞，PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平；RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平，同时检测PEDV滴度变化，以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明：PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时，试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，在48 h时表达量最高，且差异极显著(P<0.01),自噬被激活；RT-qPCR结果显示，TRIM5α的表...     

GST-P58IPK融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1.将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定.结果显示,大肠杆菌细胞经诱导表达出相对分子质量约为85 000的蛋白,与GST-P58IPK融合蛋白大小相符;Western-blot显示该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别,磷酸化试验表明GST-P58IPK融合蛋白能够抑制PKR的体外磷酸化.结果表明,在大肠杆菌表迭系统中表达了有活性的GST-P58IPK融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础.     

稳定表达IL-10的PK-15细胞的构建及其在PCV2增殖中的应用

【目的】 研究白细胞介素-10（IL-10）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】 利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体（pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro）进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验（IFA）观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度（TCID₅₀）。【结果】 试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5 μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID₅₀在感染后48 h极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。【结论】 本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。     

H9N2流感病毒诱导MDCK细胞自噬对病毒复制的影响

本试验旨在研究H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发的细胞自噬对病毒复制的影响。试验首先建立了稳定表达GFP-LC3的 MDCK细胞系,该细胞系经H9N2流感病毒感染后,激光共聚焦观察到了绿色荧光的点状聚集,得出H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发细胞自噬。随后试验利用3-MA抑制细胞自噬、Rapamycin诱导细胞自噬,荧光定量PCR检测NP mRNA水平,TCID50检测病毒的滴度进行细胞自噬与病毒复制的研究。结果表明： Rapamycin可显著增加NP mRNA水平和病毒滴度（P ＜ 0.01）|3-MA可以显著降低NP mRNA水平和病毒滴度（P ＜ 0.01)。说明H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发的细胞自噬可促进流感病毒的复制。 [关键词] H9N2 流感病毒|细胞自噬|病毒复制|MDCK细胞|诱导     

Fas对镉暴露致大鼠大脑皮质自噬体形成的影响

为探究死亡受体Fas在镉暴露致大鼠大脑皮质自噬体形成中的作用,将24只21日龄雄性SD大鼠随机分为4组,分别为对照组、镉组、镉与对照病毒共处理组、镉与Fas基因沉默病毒共处理组。试验期间,对照组大鼠自由饮用纯净水,病毒处理组大鼠于第1天以每只1.4×10¹¹vg的剂量通过尾静脉注射相应病毒,4周后镉染毒组大鼠自由饮用镉水(50 mg·L^-1),持续90 d。试验结束后,透射电镜观察大脑皮质中自噬体数量,Western blot检测大脑皮质细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)、p-Erk1/2、自噬相关蛋白7(ATG7)、自噬相关基因(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达水平,免疫荧光染色检测LC3表达水平。结果显示,镉暴露增加大脑皮质中自噬体数量,极显著激活Erk1/2并上调ATG7、Beclin-1、LC3蛋白表达水平(P<0.01);Fas基因沉默抑制镉引起的自噬体数量增加,极显著抑制镉致Erk1/2激活及ATG7、Beclin-1、LC3蛋白表达水平升高(P<0.01)。结果表明,Fas通过激活Erk1/2参与镉致大鼠大脑皮质自噬体形成。     

氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸对破骨细胞自噬和分化的影响

为了探究氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)对破骨细胞自噬及分化能力的影响,以BALB/c小鼠骨髓巨噬细胞诱导分化形成的破骨细胞为研究对象,添加0.5 mmol·mL~(-1)AICAR(AMPK激活剂)处理4 h后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞;CCK-8法检测破骨细胞存活率;高内涵系统分析TRAP~+细胞比率、面积、荧光强度及圆度;蛋白免疫印迹(Western blot)和荧光定量聚合酶链式反应方法(qRT-PCR)检测AMPK、NFATc1、c-Fos、CTSK、TRAP、(LC3-Ⅱ)、ATG5、Beclin1、p62的mRNA和蛋白水平;激光共聚焦显微镜观察EGFP-pmCherry-LC3荧光聚点。结果显示,通过30 ng·mL~(-1)M-CSF和60 ng·mL~(-1)RANKL诱导分化4 d的细胞TRAP染色后大部分呈阳性且细胞核数目≥3。AICAR处理后,与对照组相比,细胞存活率无显著差异(P0.05),但细胞面积、TRAP~+(细胞核数目≥3)细胞率、TRAP荧光强度显著下降(P0.05)。AICAR组破骨细胞c-Fos、TRAP(P0.01)、p62(P0.05)的mRNA水平显著下降,LC3、ATG5的mRNA水平显著升高(P0.05)。AICAR处理致AMPKα蛋白磷酸化水平极显著升高(P0.01),NFATc1、c-Fos、CTSK、p62(P0.01)和TRAP(P0.05)蛋白表达量显著下调,LC3-Ⅱ、ATG5和Beclin1蛋白表达水平极显著上调(P0.01)。转染LC3质粒结果显示AICAR处理后LC3黄色及红色荧光聚点数目增多,绿色荧光聚点数目减少。结果表明0.5 mmol·mL~(-1)AICAR作用4 h可激活破骨细胞AMPKα,增强破骨细胞的自噬水平,但抑制了破骨细胞的分化。     

BCG诱导RAW264.7细胞脂肪酸氧化对细胞自噬和促炎因子表达的调控作用

旨在探究脂肪酸氧化（fatty acid oxidation,FAO）对BCG介导的RAW264.7细胞自噬和促炎因子表达的调控作用。用BODIPY染色和游离脂肪酸定量试剂盒检测BCG感染后RAW264.7细胞中脂滴聚集情况以及脂肪酸含量;Western blot检测BCG感染对肉毒碱棕榈酰基转移酶1A （CPT-1A）表达的影响;Etomoxir （100 μmol·L^-1）预处理细胞2 h后,BCG感染细胞6 h,检测RAW264.7细胞中BCG存留量,并用Western blot方法检测自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-II）和溶酶体蛋白（Rab7）的表达情况;用免疫荧光方法和mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒分别检测自噬小体聚集和自噬流;荧光定量PCR和ELISA分别检测促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达情况以及在细胞培养上清中的含量。结果显示,BCG感染促进RAW264.7细胞中脂滴聚集和CPT-1A的表达,而游离脂肪酸含量降低;Etomoxir预处理抑制了细胞中BCG存活,并上调了Beclin1、LC3-II和Rab7表达,且细胞中出现大量自噬小体聚集,自噬流增强,却抑制了促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达与分泌。综上表明,抑制FAO可促进BCG感染诱导的RAW264.7细胞自噬,并抑制BCG感染引起的炎症反应。     

细胞自噬对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

本研究旨在了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)诱导的细胞自噬在病毒感染过程中所起的作用。用Oregon C24V株感染MDBK细胞,以Western blot、间接免疫荧光、透射电镜三种方法鉴定细胞自噬的产生;通过自噬抑制药物Wortmannin和自噬基因Beclin-1的RNAi干扰阻断自噬,探究自噬对BVDV复制的影响。结果显示,病毒感染可以引起LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化及p62的降解;转染GFP-LC3质粒的细胞,在病毒感染后出现增多的聚集颗粒;透射电镜能观察到细胞中出现大量的双层膜结构;此外,抑制细胞自噬或干扰Beclin-1的表达,细胞上清中病毒的滴度及病毒蛋白质的表达量都有所降低。BVDV感染早期可以诱导自噬的产生,且自噬对病毒的复制有利。     

SNAT2介导蛋氨酸对牛乳腺上皮细胞增殖与自噬的调节作用

钠离子依赖性中性氨基酸转运体2(SNAT2)是一种氨基酸转运蛋白,可转运中性氨基酸,广泛分布于多种细胞中。氨基酸既可作为蛋白质合成的底物,也是调节细胞新陈代谢的关键信号分子,但SNAT2是否介导氨基酸调节BMECs增殖和自噬尚未见报道。本研究利用CASY细胞计数和Western blotting技术检测SNAT2过表达和siRNA干扰后牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖情况以及SNAT2对自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表达量的影响,并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点(LC3-Ⅱ)变化。结果显示,SNAT2过表达时,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量增加,反之,p-PI3K、p-mTOR和Cyclin D1表达量下降。SNAT2抑制时,LC3-Ⅱ表达量增加,免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖(trehalose,Tre)和蛋氨酸(methionine,Met)后,与单一添加Tre组相比,Met+Tre组p-mTOR表达量增加,LC3-Ⅱ表达量降低,胞浆内绿色自噬斑点减少;添加Tre和Met并抑制SNAT2时,p-mTOR表达量下降,LC3-Ⅱ表达量增多,胞浆内绿色自噬斑点增加。以上结果表明,SNAT2可介导Met通过调控PI3K-mTOR/Cyclin D1信号通路调节BMECs的增殖与自噬。     

脂肪酸结合蛋白4对BCG诱导巨噬细胞自噬的调控作用

旨在探讨脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein,FABP4）在牛分枝杆菌卡介苗（BCG）感染的巨噬细胞中对脂肪酸代谢与自噬的调控作用。本研究利用小干扰RNA技术敲减小鼠巨噬细胞系RAW264.7中FABP4的表达,并结合BCG感染,采用免疫印记和免疫荧光等技术,检测了FABP4蛋白表达、脂肪酸累积、脂肪酸β氧化和自噬相关蛋白表达等指标。结果表明,BCG感染极显著上调了小鼠巨噬细胞RAW264.7中FABP4的表达（P<0.001）并促进了脂肪酸的累积。FABP4小干扰RNA（siRNA-FABP4）能显著降低BCG感染后巨噬细胞中脂肪酸含量,伴随着肉毒碱棕榈酰移位酶1A（CPT1A）的表达上调（P<0.05）,与ATP产量的提升（P<0.05）。同时,siRNA-FABP4极显著下调了自噬调控关键因子AMPK及自噬相关蛋白p-ULK1、ATG5、ATG7、ATG12和LC3B的表达（P<0.01）。以上研究结果表明,在BCG感染RAW264.7细胞过程中,下调了FABP4的表达,促进了脂肪酸的氧化,减少了巨噬细胞内脂肪酸的含量,并通过AMPK信号通路抑制了细胞自噬的发生。