转录因子PAX4调控湖羊FSHR基因转录活性

本研究旨在了解湖羊FSHR基因5′-UTR序列特征和转录因子调控,为揭示湖羊FSHR基因转录调控机制提供依据。采集3只成年湖羊母羊的心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、大肠、小肠、子宫和卵巢11种组织,采用PCR扩增和克隆测序技术获得湖羊FSHR基因5′-UTR序列,生物信息学方法分析其序列特征,RT-PCR技术分析转录因子PAX4在湖羊11种组织中的表达情况;合成湖羊PAX4基因过表达载体pcDNA3.1-PAX4,并将其转染到猪卵巢颗粒细胞(GCs),用流式细胞仪测定了GCs的细胞凋亡率。双荧光素酶报告基因系统检测PAX4对湖羊FSHR基因转录活性的影响。结果表明,湖羊FSHR基因5′-UTR全长为161bp,含有典型的E-box、CAAT-box和GC-box等转录调控元件以及GATA-2、Sp1和PAX4等转录因子结合位点。转录因子PAX4在湖羊各组织中均有表达,其中在卵巢组织中等表达。湖羊PAX4过表达载体可在卵巢颗粒细胞高效表达(P0.01)。过表达湖羊PAX4基因后,卵巢颗粒细胞凋亡率显著上升(P0.05),卵巢颗粒细胞和COS-7细胞中FSHR基因5′-UTR双荧光素酶报告载体的荧光素酶活性显著(P0.05)或极显著(P0.01)下调。综上表明,转录因子PAX4抑制湖羊FSHR基因转录活性,从而促进卵巢颗粒细胞凋亡。     

湖羊PGR基因对卵泡颗粒细胞体外增殖与凋亡的影响

旨在探究孕酮受体(progesterone receptor,PGR)基因对湖羊卵泡颗粒细胞体外增殖与凋亡的影响。利用RT-PCR技术扩增和克隆获得PGR基因编码序列(CDS),通过生物信息学软件对其氨基酸序列及同源性进行比对;用所获得序列构建过表达载体和干扰siRNA,分别转染湖羊颗粒细胞,并用CCK8技术检测颗粒细胞的细胞活力;采用RT-qPCR和Western blot技术,检测细胞周期和凋亡的相关基因或蛋白表达水平。结果显示,羊PGR基因的CDS区全长2736 bp,编码911个氨基酸;与其他物种氨基酸序列的同源性为39.66%~95.44%。干扰PGR基因通过下调CDK4、Bcl-2和上调Caspas3、Caspase8、BAX基因mRNA的表达(P<0.05),进而抑制颗粒细胞的增殖,但对CyclinD1未产生影响(P>0.05);过表达PGR基因通过上调CDK4、CyclinD1、Bcl-2和下调Caspase3、Caspase8、BAX基因mRNA的表达(P<0.05),进而促进颗粒细胞的增殖;BAX蛋白表达变化与对应mRNA的表达趋势一致(P<0.05);过表达PGR基因显著上调PCNA基因表达,而干扰PGR基因则下调PCNA蛋白表达(P<0.05)。研究表明,PGR基因通过调控细胞周期和凋亡关键基因的表达,影响湖羊颗粒细胞的增殖与凋亡,进而调节湖羊卵泡发育。     

FOXO3基因过表达对鹅卵泡颗粒细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响

本研究首先克隆鹅FOXO3基因编码区(CDS)序列,构建FOXO3基因的真核表达载体,然后将其转染至鹅卵泡颗粒细胞中,利用荧光定量PCR方法检测FOXO3基因对细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响。结果显示,本研究成功克隆了鹅FOXO3基因CDS序列,并由此构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXO3。鹅卵泡颗粒细胞FOXO3基因过表达实验发现,过表达组凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Fasl的mRNA表达水平较对照组均升高(P<0.05),而自噬相关基因LC3和Beclin1的mRNA表达水平较对照组均降低(P<0.05)。本研究结果表明,FOXO3基因可能影响鹅卵泡颗粒细胞中凋亡及自噬相关基因的表达,进而调控颗粒细胞的凋亡和自噬。     

山羊FST慢病毒载体构建及其对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

研究卵泡抑素(FST)对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响。采集山羊卵巢组织、分离培养原代卵巢卵泡颗粒细胞,RT-PCR克隆山羊FST,设计shRNA片段,构建慢病毒过表达载体和干扰载体,感染原代卵巢卵泡颗粒细胞,qPCR技术检测过表达与干扰的效果, CCK-8检测细胞的增殖效果。结果显示:分离培养的山羊卵巢卵泡颗粒细胞经促卵泡素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,阳性率为95%;慢病毒感染颗粒细胞时荧光蛋白的表达占比80%;qPCR验证FST过表达和干扰慢病毒载体的效果均显著(P0.05);过表达FST显著(P0.05)抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,干扰FST显著(P0.05)促进卵巢卵泡颗粒细胞增殖。笔者分离出山羊卵巢卵泡颗粒细胞,成功构建FST过表达和干扰两种慢病毒载体,感染结果表明FST能够抑制山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,为进一步研究FST在哺乳动物卵泡发育调控中的作用及其机制提供了基础资料。     

CRABP1过表达载体的构建及其对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响

本实验通过构建猪视黄酸结合蛋白1(Cellular Retinoic Acid-Binding Protein1,CRABP1)过表达载体并揭示其对猪卵泡颗粒细胞凋亡的效应。从猪卵巢组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR克隆CRABP1基因,并使用T4连接酶将其连入pcDNA3.1载体,进一步转化到感受态细胞中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取去内毒素质粒。随后将构建好的CRABP1过表达质粒转染猪卵泡颗粒细胞,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其转染效率及其对凋亡相关基因的影响,再将CRABP1过表达质粒转染至猪颗粒细胞24 h后添加1 nmol/L全反式视黄酸(All-trans Retinoic Acid,ATRA),检测其凋亡相关基因的表达变化。结果显示:CRABP1扩增片段序列与参考序列一致,将CRABP1过表达质粒转染猪颗粒细胞24 h后,其CRABP1基因表达量极显著升高,说明CRABP1过表达载体构建成功;CRABP1过表达载体单独转染颗粒细胞后,其可促进猪颗粒细胞促凋亡基因Bax、Caspase-3和Fas的mRNA表达,并且CRABP1过表达可逆转ATRA对猪颗粒细胞的抑凋亡作用。结果表明猪CRABP1过表达载体构建成功,其可介导ATRA调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。     

干扰Sirt2表达对绵羊颗粒细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响

Sirt2对雌性动物的生殖具有重要调节作用,实验旨在探讨小干扰RNA(siRNA)干扰颗粒细胞Sirt2表达后,对绵羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。首先利用免疫荧光染色检测FSHR以鉴定颗粒细胞纯度,qRT-PCR检测干扰效率,随后利用MTT法检测干扰Sirt2表达后对细胞增殖的影响,最后利用qRT-PCR检测凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2及抗氧化相关基因FoxO3a、SOD2、CAT、GPX4的表达,利用DCFH-DA探针检测活性氧(ROS)水平。结果显示:10 nmol/L si-Sirt2转染颗粒细胞24 h后能抑制Sirt2的表达(P0.05),且对细胞增殖无显著性影响;干扰Sirt2表达后可促进促凋亡基因Caspase3和Bax的表达(P0.05)、抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达(P0.05),提高细胞内ROS水平并降低抗氧化相关基因FoxO3a、SOD2、CAT、GPX4的表达(P0.05)。因此,干扰绵羊颗粒细胞Sirt2表达不会影响细胞增殖,但会促进细胞凋亡并对细胞抗氧化能力产生不利影响。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组(P0.01),输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组(P0.05),其他组织未达到差异显著性(P0.05)。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组(P0.05),P4含量在12 h显著高于对照组(P0.05);超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用(P0.05),48、72 h达到极显著促进作用(P0.01),并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低(P0.01)。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

Wortmannin抑制Wnt/β-Catenin通路对猪卵巢颗粒细胞发育的影响

为探究PI3K通路与Wnt/β-Catenin通路在猪卵巢颗粒细胞发育中的互作关系以及调控功能,以不同浓度(DMSO,0.1,1,1.5,3,5μM)PI3K通路抑制剂Wortmannin处理体外培养猪卵巢颗粒细胞48 h,CCK-8法检测猪卵巢颗粒细胞细胞活力,Western Blot法检测β-Catenin蛋白水平;5μM Wortmannin处理体外培养猪卵巢颗粒细胞48 h,实时定量PCR检测猪卵巢颗粒细胞内类固醇生成、激素受体和细胞凋亡相关基因的表达。结果表明,Wortmannin处理猪卵巢颗粒细胞可抑制颗粒细胞细胞增殖活力,其中3μM和5μM Wortmannin,相对其他处理组,显著地(P0.05)降低细胞增殖活力;对应的,不同浓度的Wortmannin也阻遏Wnt/β-Catenin通路,对比其他组,3μM和5μM Wortmannin处理组抑制效果最显著(P0.05);实时定量PCR检测结果表明,5μM Wortmannin处理显著下调猪卵巢颗粒细胞CYP19A1(P0.001)和CYP11A1(P0.01)mRNA水平,抑制激素受体基因FSHR和LHCGR基因表达(P0.05),促进Caspase3(P0.05)和PTSG2(P0.01)表达。综上所述,Wortmannin抑制猪卵巢颗粒细胞Wnt/β-Catenin通路,诱导细胞活力下降,促进细胞凋亡,并且阻碍激素受体表达和类固醇激素合成。     

水牛BMP1基因对颗粒细胞增殖与凋亡的功能研究

本研究旨在探讨BMP1基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖与凋亡的影响,采用qRT-PCR检测体外培养0、24、48、72和96h水牛颗粒细胞中BMP1基因的表达规律,通过在水牛颗粒细胞培养液中添加BMP1基因重组蛋白和抗BMP1抗体,观察其对体外培养水牛颗粒细胞增殖变化的影响,并应用qRT-PCR和Western blotting方法检测与细胞增殖和细胞凋亡相关因子表达的变化规律。结果显示,随着颗粒细胞体外培养时间的延长,BMP1基因的相对表达量显著上调(P0.05),96h培养组BMP1表达最高。添加BMP1重组蛋白可显著促进水牛颗粒细胞的体外增殖(P0.05),并能够显著上调细胞周期关键蛋白Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA mRNA表达水平(P0.05),同时显著抑制了细胞凋亡信号通路中促凋亡相关因子(Fas、FasL、TNFR1、TNF-α、Cytochrome C、Apaf1、Chop、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9)mRNA表达(P0.05)。Western blotting检测结果表明,BMP1重组蛋白能够抑制Fas、Bax和Caspase-9蛋白表达,蛋白与mRNA表达一致。而添加抗BMP1抗体的试验则得出相反的结果。综上表明,BMP1基因能通过调控相关基因的表达促进体外培养水牛颗粒细胞的增殖并抑制其凋亡,在水牛卵泡发生过程中具有重要的调控功能,为阐明BMP1基因参与家畜卵泡发生的分子机制奠定基础。     

p38MAPK抑制剂SB202190对猪颗粒细胞活力的影响

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated potein kinase,MAPK)家族成员,是细胞内重要的信号转导系统之一,对细胞的生长、分化、凋亡具有重要影响及作用。为探究p38MAPK信号对猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响及其可能作用机制,研究以体外培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,在培养液中分别添加浓度为0、1、10、20μmol/L的p38MAPK特异性抑制剂SB202190。以免疫细胞化学染色法鉴定体外培养猪卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测其增殖活性,应用Annwxin V-FITC/PI及细胞周期试剂盒染色检测细胞凋亡及细胞周期状况,以实时定量PCR检测猪卵巢颗粒细胞中凋亡、周期相关基因的相对表达水平。结果表明,添加p38APK信号抑制剂SB202190可抑制体外培养猪卵巢颗粒细胞的增殖活性,20μmol/L处理组与其他组相比呈显著性差异(P0.05);20μmol/L SB202190添加处理未显著影响颗粒细胞的凋亡水平,而该浓度SB202190可将大部分细胞阻滞在G1/G0期,与对照组相比差异显著(P0.05);基因相对表达水平检测显示SB202190添加可抑制Fas、FasL、CDK-4的表达,而同时促进Bcl-2、Bax、P27的表达(P0.05),对Caspase-3的表达没显著影响(P0.05)。综上所述,SB202190通过调控猪卵巢颗粒细胞的周期来影响其增殖作用,但对其凋亡没有影响。     

猪ALAS1基因的克隆、序列分析及表达模式的研究

目的:首先克隆了猪ALAS1(5-aminolevulinate synthase 1)DNA序列,并对CDS序列进行了序列分析,分析了该基因的表达模式。方法:以4月龄长大母猪的卵巢为材料,运用同源序列克隆技术,对猪ALAS1 DNA序列进行克隆并对其进行生物信息学分析;利用性腺激素处理卵巢颗粒细胞并结合RT-PCR方法分析了猪ALAS1基因的表达模式。结果:克隆得到了猪ALAS1 DNA序列9 137 bp,其中包括53 bp的5'非编码区序列、1 922 bp的CDS序列和2~9内含子序列,共编码640个氨基酸;猪ALAS1蛋白氨基酸序列与人和小鼠的相似性一致(100%);ALAS1蛋白的分子量约为38.0 KDa,等电点为9.07,可能存在10个PKC磷酸化位点、1个CAMP磷酸化位点、4个N-糖基化位点、12个豆蔻酰化位点、3个CKII磷酸化位点和1个酰胺位点,还包含1个天冬酰胺转氨酶超家族(AAT-1)保守结构域;猪ALAS1在性腺激素处理2个卵巢颗粒细胞后,可检测到该基因在卵巢颗粒细胞中的显著性表达,之后其表达量迅速下降,12 h后表达量又提高,之后表达量再次迅速下降。结论:猪ALAS1基因的CDS区在物种间保守性强,推测猪ALAS1基因参与卵泡的发育和排卵及在黄体化过程中发挥一定作用。     

肿瘤转移抑制因子(Kisspeptin)对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

肿瘤转移抑制因子(Kisspeptin)在颗粒细胞上有表达,但其对颗粒细胞凋亡的作用尚不清楚,本试验旨在利用流式细胞术和荧光定量PCR的技术研究Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响。向DMEM-F12培养液中分别添加0、100 nmol/L的Kp-10培养牛颗粒细胞,24 h后收集细胞,用流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期,用荧光定量PCR技术检测Caspase-3、Bcl-2、Fas和Fasl的m RNA表达。结果表明:Kisspeptin可显著促进牛颗粒细胞凋亡,且伴随着Caspase-3、Fas和Fasl m RNA表达上调及Bcl-2 m RNA表达下调(P0.01);流式细胞分析表明,Kisspeptin可使牛颗粒细胞在G1期增加、S期下降(P0.05)。研究结果说明,Kisspeptin可促进牛颗粒细胞凋亡,这一作用可能通过上调促凋亡基因Caspase-3、Fas、Fasl和下调抗凋亡基因Bcl-2的m RNA表达实现。     

藏羊HSP27基因过表达和沉默载体构建及对卵泡发育的功能初步分析

为了深入探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的作用,本研究选择健康的（3~4岁）经产藏母羊6只,屠宰获得卵巢组织进行藏羊HSP27基因克隆,利用生物信息学方法分析HSP27基因CDS区序列,构建HSP27基因过表达及沉默载体,分离培养藏羊卵巢颗粒细胞,将构建的载体按不同分组进行细胞转染试验即空白组、过表达载体组、沉默载体组、阴性对照组,每组设3个复孔。显微镜观察各转染组培养0、24、48、72 h的细胞形态变化及细胞计数,RT-PCR检测各转染组HSP27、GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量。结果,试验成功克隆藏羊HSP27基因,其CDS序列长度为618 bp,编码203个氨基酸。试验成功构建藏羊HSP27基因过表达及沉默载体;将构建的载体转染至卵巢颗粒细胞,随着培养时间的递增各转染组间细胞形态发生改变,过表达载体组细胞由长梭状逐渐变为不规则多边形,细胞核变形分解,沉默载体组细胞周边伪足伸出减少,细胞皱缩大量凋亡;细胞计数结果显示,转染后培养72 h时,沉默载体组细胞数量极显著低于其他3组（P<0.01）,过表达载体组细胞数量显著低于空白组和阴性对照组（P<0.05）。RT-PCR结果显示,过表达载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）,过表达载体组细胞的GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量均极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞Erβ基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）。由此可初步推测,当HSP27基因过表达时能够促进颗粒细胞增殖分化,当沉默HSP27基因时可能会触发颗粒细胞凋亡进而影响卵泡发育,以上研究成果可为HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的功能研究奠定试验基础。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组（P<0.01）,输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组（P<0.05）,其他组织未达到差异显著性（P>0.05）。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组（P<0.05）,P4含量在12 h显著高于对照组（P<0.05）;超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用（P<0.05）,48、72 h达到极显著促进作用（P<0.01）,并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低（P<0.01）。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

miR-144-5p靶向WNT5a对山羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响

旨在探究miR-144-5p靶向WNT5a对山羊颗粒细胞增殖和凋亡的影响。本研究选用2岁健康雷州母山羊的卵巢颗粒细胞来过表达和抑制表达miR-144-5p及WNT5a,通过荧光定量PCR(real-time qPCR, RT-qPCR)、Western blot、双荧光素酶报告基因、CCK-8等技术来探究miR-144-5p与WNT5a对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，miR-144-5p在大卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于小卵泡颗粒细胞(P<0.01),WNT5a在大卵泡颗粒细胞中的表达量极显著低于小卵泡颗粒细胞(P<0.01);CCK-8检测发现，miR-144-5p抑制了GCs增殖，过表达miR-144-5p后，抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达极显著下调(P<0.01),促凋亡基因BAX的mRNA和蛋白表达极显著上调(P<0.01);Wnt/β-Catenin通路CTNNB1 mRNA和β-Catenin蛋白水平极显著降低(P<0.01);另外，miR-144-5p能靶向WNT5a抑制其表达。同时，CCK-8检测结果表明，WNT5a可促进...     

miR-23a-27a-24簇在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用

为了解猪miR-23a-27a-24簇的序列及结构特征，分析其在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用，采用测序技术获得猪miR-23a-27a-24簇前体序列；利用生物信息学方法分析miR-23a-27a-24簇的序列信息、结构和生物学功能；使用双酶切法构建猪miR-23a-27a-24簇的过表达载体，转染至体外培养的猪卵巢颗粒细胞中，qRT-PCR检测过表达效果；通过流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果显示：猪miR-23a-27a-24簇前体序列长度为408 bp,核苷酸序列与其他哺乳动物的一致性较高；哺乳动物miR-23a-27a-24簇均位于基因组中ZSWIM和miR-181c基因之间，成员转录顺序相同、间距相近；功能富集分析发现，miR-23a-27a-24簇的靶基因主要富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控的生物学过程和PI3K-Akt信号通路中；成功构建猪miR-23a-27a-24簇的过表达载体，且在猪卵巢颗粒细胞中高效表达；流式细胞术分析发现，转染miR-23a-27a-24簇过表达载体能够显著提高颗粒细胞的凋亡率(P<0.05),极显著提高颗粒细胞早期凋亡率(P<0...     

姜黄素对水牛卵巢颗粒细胞体外培养的影响

本试验研究了添加姜黄素对水牛卵巢颗粒细胞体外培养过程中增殖、凋亡自噬及间隙连接等生物学过程的影响。设置不同浓度(1,5,10,25,50,100μg/m L)的姜黄素,对颗粒细胞的凋亡、增殖、自噬和间隙连接等基因与蛋白的表达进行定性与定量检测,发现高浓度姜黄素会导致细胞凋亡标记Caspase-3及自噬基因Beclin-1的基因表达量上升,间隙连接蛋白Cx43基因表达量下降,细胞增殖标记PCNA表达量无显著变化。研究结果为姜黄素在调节卵巢颗粒细胞功能提供了一定的理论依据。     

HSD17B12对兔卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

本实验旨在研究羟基类固醇17-β脱氢酶12(17β Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 12,HSD17B12)对兔卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响。首先克隆了兔HSD17B12基因,进行生物信息学分析;分离原代兔颗粒细胞(Granulosa Cells,GCs),并利用FSHR免疫荧光法进行鉴定;构建HSD17B12基因过表达质粒及干扰RNA,转染GCs,利用qRT-PCR检测HSD17B12对增殖、凋亡相关基因的调控作用,并利用流式细胞、CCK8等方法检测HSD17B12对GCs增殖、凋亡的影响。结果显示：(1)利用FSHR免疫荧光染色,鉴定分离原代细胞是GCs,FSHR表达呈阳性。(2)克隆HSD17B12基因,发现其cDNA全长为938 bp,编码312个氨基酸。进化树显示兔与黑猩猩(Pan Troglodytes)、猕猴(Macaca Mulatta)等聚在一起,鸡(Gallus Gallus)为外支。(3)过表达HSD17B12可以提高增殖相关基因AKT1-1的表达(P<0.01),降低凋亡相关基因Bad、Fas、FasL、P53(P<...     

WNT2在绵羊卵泡颗粒细胞的表达及功能研究

旨在探究WNT2在绵羊卵泡颗粒细胞(GCs)中的表达及功能。本研究选取4～6月龄健康母羊20只,采集双侧卵巢,免疫组化技术检测WNT2蛋白在卵泡中的表达定位;qRT-PCR及Western blot技术检测其在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达差异;siRNA沉默GCs中的Wnt2基因后,qRT-PCR技术检测Wnt2基因及参与经典WNT信号通路关键基因CTNNB1的相对表达量,并测定GCs凋亡情况。结果表明:1)WNT2蛋白在绵羊卵泡内膜细胞、颗粒细胞以及卵丘细胞内均有表达。2)qRT-PCR及Western blot结果基本一致,均表明Wnt2 mRNA及蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞表达差异显著(P0.05),且在大卵泡颗粒细胞内表达量显著高于中卵泡颗粒细胞(P0.05),中卵泡颗粒细胞内表达量显著高于小卵泡颗粒细胞(P0.05)。3)基因沉默后,沉默组Wnt2和CTNNB1的表达量均显著低于无义序列siRNA组(NC组)以及空白对照组(P0.05),而Wnt2基因沉默组细胞凋亡率显著高于其他两组(P0.05)。综上表明,WNT2是通过WNT2/CTNNB1信号通路促进绵羊卵泡颗粒细胞生物学功能的。     

山羊先天免疫TLR4基因克隆、组织表达分析及其凋亡功能初探

为了解山羊TLR4的分子结构、表达特性和免疫调节功能,试验以NCBI中山羊TLR4基因预测序列为模板,采用RACE扩增技术获得初生羔羊TLR4基因c DNA序列,并进行生物信息学分析,利用qRT-PCR技术检测羔羊各组织TLR4基因表达量,构建p EGFP-N1-TRL4重组质粒检测在真核细胞中的凋亡功能。结果表明:克隆得到TLR4基因c DNA序列长2 728 bp,CDS全长2 526 bp,编码841个氨基酸。山羊TLR4蛋白是1个跨膜蛋白,胞外包含2个LRRs-RI、1个LRRs_8及1个TPKR-C2,胞内含有TIL受体结构域、77个潜在磷酸化位点、9个糖基化位点,且与绵羊TLR4氨基酸序列同源性最高。TLR4基因在脾脏中的表达量较高(P0.05),肝脏、胸腺和肾脏依次减少,颌下腺、肺脏及血液较脾脏显著降低(P0.05)。说明试验成功构建具有TLR4基因完整CDS序列的p EGFPN1-TLR4重组载体,且能够在HEK293T细胞中正常表达,具有加快细胞凋亡的作用。山羊TLR4基因编码蛋白具有免疫学结构和功能特征,在免疫器官中可能参与细胞凋亡过程。