堆肥土壤中黄曲霉毒素降解菌株的筛选及活性分析

为了筛选能稳定高效降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的细菌,本试验以香豆素培养基进行初筛,AFB1标准品进行复筛,从动物粪便堆肥土壤中获得降解率最高的菌株,命名为SG16,并初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通过研究各发酵组分的降解率,不同p H、温度、金属离子等因素下发酵液的降解活性,以及浓缩发酵液对发霉玉米中AFB1降解的效果。结果显示:各组分中发酵上清液降解率最高为80.62%,菌悬液和胞内液的降解率仅为14.32%和10.67%,温度、p H、金属离子、蛋白酶K均能影响其毒素降解活性,因此SG16产生的降解AFB1活性物质初步鉴定为胞外酶。浓缩发酵液能显著降低霉变玉米中AFB1的含量,这为生物防治饲料或粮食中的黄曲霉污染提供资源。     

玉米赤霉烯酮降解菌株的筛选及降解特性研究

本试验旨在筛选能够有效降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的微生物菌株。试验以ZEN为唯一碳源对发霉饲料、动物粪便等样品中的菌株进行分离筛选,选取其中降解率较高的菌株进行鉴定。研究菌株不同活性成分的ZEN降解效率以及不同培养条件下菌株的ZEN降解效率,初步探明菌株降解机制,优化菌株降解条件,并通过小鼠试验评价菌株的体内ZEN降解效果。结果表明:从样品中筛选出2株能有效降解ZEN的菌株,分别命名为NA-J21和MLS-H32,经鉴定分别是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。37℃培养48 h,菌株NA-J21与MLS-H32的ZEN降解率分别为71.3%和61.5%。2株菌主要通过细胞分泌的胞外酶降解ZEN,此外菌株细胞壁对ZEN有一定的吸附能力。菌株NA-J21降解ZEN的最适条件为接种量2.0%,初始pH 7.0,温度37℃,培养时间12 h;菌株MLS-H32的最佳ZEN降解条件为接种量2.5%,初始pH 7.0,温度32℃,培养时间12 h。菌株NA-J21和MLS-H32能够缓解ZEN中毒引起的小鼠脏器损伤,对ZEN污染小鼠有一定治疗效果。综上所述,本试验筛选的菌株NA-J21和MLS-H32能够有效降解ZEN,是微生物降解ZEN的良好选择。     

一株同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B_1的谷氨酸棒状杆菌及其降解特性研究

试验旨在筛选同时降解玉米赤霉烯酮(ZEN)和黄曲霉毒素B_1(AFB_1)的菌株,并研究其对两种毒素的降解特征。从土壤及鸡、驴的食糜中筛选出9株可同时降解ZEN和AFB_1的菌株;编号为406的菌株经形态学观察和16S rDNA鉴定为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamate)。谷氨酸棒状杆菌406降解ZEN和AFB_1活性成分存在于发酵上清液中,其对ZEN和AFB_1的降解率分别为50%和58%。通过热、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠(SDS)处理,初步确定降解活性物质为一种胞外酶。上清液对ZEN和AFB_1的最适降解温度为67℃,最适pH值为8。本研究筛选到的同时降解ZEN和AFB_1的谷氨酸棒状杆菌菌株406为食品和饲料中ZEN和AFB_1的生物降解提供菌种资源。     

一株高效降解蚕蛹蛋白的菌株筛选与初步鉴定

筛选、鉴定能高效降解缫丝蚕蛹蛋白的菌株,用于提高缫丝蚕蛹生产食品和动物饲料的营养价值。从蚕蛹储藏车间及周围的土壤中收集细菌,经富集培养、干酪素平板初筛和发酵蚕蛹蛋白复筛,获得一株产蛋白酶活性较高的菌株,命名为CY21。该菌株在32℃、pH 7.0条件下培养60 h后所产蛋白酶的比活力可达到272.7 U/mg。通过形态学观察、经典生理生化试验以及16S rDNA序列系统发育分析,初步确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)亲缘关系很近的一个菌株。     

1株降解黄曲霉毒素B1的解淀粉芽胞杆菌的分离鉴定及其体外脱毒效果

旨在筛选出能够高效降解黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的菌株,并对其脱毒活性组分的脱毒效果进行研究,本研究以香豆素为唯一碳源对目标细菌进行初筛,以对AFB₁的降解率为指标进行复筛,并从形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析对筛选菌株进行鉴定;通过测定该菌株不同发酵组分对AFB₁的降解率,来定位其脱毒活性组分,同时采用CCK-8法测定活性组分降解AFB₁后对LMH细胞毒性,并研究了热处理、紫外线照射、强酸、强碱及蛋白酶K处理对活性组分脱毒作用的影响。结果显示,从样品中初筛分离到24株能够在初筛培养基生长良好的菌株,经复筛从中筛选到一株能高效降解AFB₁的菌株Y1-B1,其AFB₁降解率达到73.2%;经形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析确定该菌为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。对菌株Y1-B1培养物的不同组分进行的脱毒活性研究表明,不同组分对AFB₁的降解率不同,上清液的脱毒能力最强,细菌细胞裂解物的脱毒能力下降明显,菌体悬液和菌体裂解物上清的脱毒能力最差,由此确定解淀粉芽胞杆菌Y1-B1的脱毒能力主要来源于上清液中的某种活性物质;细胞毒性结果显示,与AFB₁对LMH细胞的毒性作用相比,AFB₁被上清液降解后其产物的毒性显著降低。该脱毒活性组分对不同理化因素处理呈现出不同的表现,对高温、紫外照射抵抗力较强,对强酸、强碱抵抗力较差,蛋白酶K仅造成脱毒能力部分减弱。本研究将为解决黄曲霉毒素污染问题提供新的微生物种质资源,同时为后续微生物脱毒制剂的开发奠定基础。     

降解AFB1的枯草芽孢杆菌S1分离与鉴定

【目的】筛选出能够高效降解黄曲霉毒素（aflatoxin,AF）的菌株,并对其降解活性及残留毒性进行检测,以期为黄曲霉毒素B₁（alflatoxin B₁,AFB₁）污染防治提供参考。【方法】采集耗牛、绵羊等草食性动物粪便和养殖场霉变饲料,以AFB₁的结构类似物香豆素为唯一碳源筛选降解AFB₁效率最高的菌株,并对其进行形态学、生理生化和16S rDNA鉴定。取AFB₁与适量筛选菌株的发酵液混合,使AFB₁的浓度为1 μg/mL,37℃、150 r/min培养,测定培养不同时间AFB₁降解率;应用差速离心法分别制取上清液、菌悬液和菌体,将菌体超声裂解后制得胞内液,测定不同组分对AFB₁的降解率;对上清液分别进行蛋白酶K、蛋白酶K+SDS和热处理,检测处理后上清液AFB₁降解率;分别用不同浓度的饱和硫酸铵沉淀处理上清液,检测AFB₁降解率;应用7 ku透析袋对上清液进行浓缩,检测AFB₁降解率,从而判断菌株活性成分的性质和分布。将鸡肝细胞分为AFB₁组、AFB₁-菌株组、菌株组和空白对照组,用实时荧光定量PCR检测各组鸡肝细胞中白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosisi factor alpha,TNF-α）和Bcl-2-associated X蛋白（Bax）基因的相对表达量。【结果】经初筛和复筛,从编号为S₁的绵羊粪便样品中分离出1株菌株,其降解AFB₁的活性最高,降解率可达60.36%。菌株S₁在LB固体培养基上培养12 h,可观察到淡黄色不透明菌落,表面光滑,有隆起,镜检革兰氏染色呈阳性,杆状。16S rDNA基因进行PCR扩增并进一步测序分析,其序列与LC55966.1的同源性为100%。综合16 S rDNA序列分析和生理生化结果鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌发酵液与AFB₁（1 μg/mL）反应4、12、24、48和72 h,降解率分别达到10.98%、25.36%、46.24%和52.65%和80.84%。上清液AFB₁降解率显著高于菌悬液和胞内液（P<0.05）。热处理后,上清液的AFB₁降解活性降低,而经蛋白酶K和SDS处理后降解活性基本丧失。用不同浓度饱和硫酸铵处理的上清液AFB₁降解率差异不显著（P>0.05）,而经透析浓缩后的上清液AFB₁降解率显著高于硫酸铵处理的上清液沉淀蛋白（P<0.05）。在鸡胚胎肝脏原代细胞上,与AFB₁组相比,AFB₁经枯草芽孢杆菌S₁降解后诱导IL-6、TNF-α以及Bax的表达量均显著降低（P<0.05）。【结论】筛选到1株枯草芽孢杆菌S₁,其具有较高的降解AFB₁的活性,其降解活性主要来自于培养液上清中的蛋白质;AFB₁经降解后其毒素显著降低。     

产芽孢木质素降解菌株N13的分离与鉴定

研究旨在从牛粪中筛选出1株对木质素有降解能力的细菌,并对其鉴定到种。对其形态和生理生化特征进行研究,发现其特征与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）很相近。将所测得的16S rDNA序列用BLAST软件在GenBank数据库中进行比对,选取序列相似性高的菌株,用ClustalX（1.8）软件进行16S rDNA相似性分析,Neighbor-Joining法构建系统发育树。N13菌株与Bacillus amyloliquefaciens的相似性达到99.85%,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌。     

玉米赤霉烯酮降解菌的分离、鉴定及其适宜降解条件的研究

试验旨在利用微生物降解法对饲料中存在的玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）进行快速、有效的消减。从不同地区采集了牛粪、羊粪及土壤样品共70份,并从中分离出164株菌株。利用环戊酮作为唯一碳源对这164株菌株进行初筛,再以ZEN作为唯一碳源对初筛菌株进行复筛并获得了8株ZEN降解菌株。采用高效液相色谱法（HPLC）对复筛得到的8株ZEN降解菌株进行ZEN降解率的测定,得到1株降解效果良好的菌株即NF-PJ-5号菌株。该菌株经16S rDNA序列比对、构建系统发育树、菌落形态观察及生理生化试验鉴定后确定为多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）。分别研究该菌株在不同温度、不同pH及不同菌液浓度条件下对ZEN的降解能力,评估菌株性质;同时,初步探究该菌株对ZEN的清除机理。结果显示,在28~32 ℃,pH 6.5~7.5,菌液浓度在2×10⁹ CFU/mL以上时,该菌株对ZEN保持较高的降解率。在30 ℃、pH 7.0、160 r/min培养48 h后,该菌株对初始浓度为10 μg/mL的ZEN降解率达到83%。综上,本试验筛选到1株ZEN降解能力较强的菌株,经鉴定为多食鞘氨醇杆菌。初步推测该菌株可通过产生胞外酶降解ZEN,同时该菌细胞壁对ZEN具有一定吸附能力。     

泰山枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其对黄曲霉毒素B1的降解研究

本试验旨在从泰山土壤中筛选出具有降解黄曲霉毒素B₁（AFB₁）作用的枯草芽孢杆菌,经16S rRNA基因测序鉴定为枯草芽孢杆菌,最终确定1株具有较高降解作用的枯草芽孢杆菌,命名为泰山枯草芽孢杆菌,并利用该菌株对AFB₁进行了降解率、活性组分、性质的确定及降解饲料中AFB₁效果的研究。结果表明,泰山枯草芽孢杆菌对AFB₁的降解率达90.28%,其中,泰山枯草芽孢杆菌发酵后的上清液对AFB₁的降解活性最高,确定发酵后的上清液中存在解毒活性组分;对解毒活性物质进行加热和蛋白酶K变性处理后,解毒活性显著降低,表明起解毒作用的活性物质是其分泌的一种胞外酶;应用性试验进一步证明泰山枯草芽孢杆菌能降解霉变饲料中的AFB₁,可在饲料或食品行业应用。     

呕吐毒素降解菌的筛选、鉴定及应用

为了筛选出对呕吐毒素(DON)具有降解能力的菌株,试验从土壤、发霉秸秆和动物粪便、肠道内容物等不同环境中采集样品10份,分别在LB、NA和MRS培养基中添加DON,制成改良固体培养基进行菌种初筛,将初筛得到的菌株在改良液体培养基中培养,用ELISA方法测定改良培养基中DON的降解率并对菌种进行复筛,对降解率高的呕吐毒素分解菌进行形态学和16S rDNA保守序列分析鉴定,组合所筛选和鉴定的菌种对麸皮中的天然DON进行降解试验。结果表明:通过初筛和复筛,筛选到DON降解率分别为19.1%、51.3%、66.7%的菌种3株;通过菌落特征、菌体特征等形态学观察和16SrDNA保守序列比对的分子鉴定,最终确定3株呕吐毒素降解菌分别为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌;枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌组合对麸皮发酵处理,DON降解率最高,可达71%。     

解淀粉芽孢杆菌SSY2颉颃霉菌物质的鉴定及其理化性质研究

试验旨在鉴定解淀粉芽孢杆菌SSY2的抗霉菌物质及其理化性质。通过活性组分分析、硫酸铵沉淀、超滤除盐等方法鉴定并提取抗菌物质;通过对抗霉菌物质产生的时间、酶活性、温度、酸碱度(pH)、稳定性及储存温度的检测初步确定其理化性质。结果表明,不同组分对霉菌的降解率不同,菌液上清液对霉菌的降解能力最强,菌液发酵液的降解能力次之,胞内液降解能力最差。因此,初步确定解淀粉芽孢杆菌SSY2的抗菌物质活性成分是一种胞外分泌物,主要存在于菌液上清液;经30%、60%、80%和100%饱和硫酸铵沉淀,确定最佳硫酸铵饱和浓度为60%;超滤纯化后得到分子质量大于3ku的抗菌活性物质。理化性质检测结果表明,该抗菌物质能在对数期早期(24h)开始产生;具有产蛋白酶活性,对胃蛋白酶具有一定抵抗力,但对蛋白酶K、碱性和中性蛋白酶的抵抗力较低;在60～121℃抗菌活性稳定,证明其对热不敏感;耐酸性较强,在pH 6.0～8.0环境中对霉菌的抗菌活性稳定;此外,抗菌物质具有良好的传代稳定性,可在4℃条件下长期保存。本试验结果可为后续研发霉菌生物防控制剂提供依据。     

玉米赤霉烯酮降解菌株的筛选及鉴定

本试验旨在从土壤中筛选出能降解玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的菌株。将土壤中分离的菌株接种至含2μg/m L ZEN的LB液体培养基中,37℃,180 r/min,培养24 h。采用间接竞争ELISA法检测ZEN的残留量,计算菌株的ZEN降解能力。并将降解ZEN能力较强的菌株进行形态学、生化特性和16S r DNA基因序列分析鉴定。结果显示:筛选出的菌株JM-1降解ZEN的能力可达26.27%,显著高于其他菌株(P0.05)。经形态学、生化特性和16S r DNA基因序列分析,菌株JM-1鉴定为蜡样芽孢杆菌。     

解淀粉芽孢杆菌SSY2颉颃霉菌物质的鉴定及其理化性质研究

试验旨在鉴定解淀粉芽孢杆菌SSY2的抗霉菌物质及其理化性质。通过活性组分分析、硫酸铵沉淀、超滤除盐等方法鉴定并提取抗菌物质；通过对抗霉菌物质产生的时间、酶活性、温度、酸碱度（pH）、稳定性及储存温度的检测初步确定其理化性质。结果表明，不同组分对霉菌的降解率不同，菌液上清液对霉菌的降解能力最强，菌液发酵液的降解能力次之，胞内液降解能力最差。因此，初步确定解淀粉芽孢杆菌SSY2的抗菌物质活性成分是一种胞外分泌物，主要存在于菌液上清液；经30%、60%、80%和100%饱和硫酸铵沉淀，确定最佳硫酸铵饱和浓度为60%；超滤纯化后得到分子质量大于3 ku的抗菌活性物质。理化性质检测结果表明，该抗菌物质能在对数期早期（24 h）开始产生；具有产蛋白酶活性，对胃蛋白酶具有一定抵抗力，但对蛋白酶K、碱性和中性蛋白酶的抵抗力较低；在60~121℃抗菌活性稳定，证明其对热不敏感；耐酸性较强，在pH 6.0~8.0环境中对霉菌的抗菌活性稳定；此外，抗菌物质具有良好的传代稳定性，可在4℃条件下长期保存。本试验结果可为后续研发霉菌生物防控制剂提供依据。     

降解赤霉烯酮芽孢杆菌的筛选、鉴定及性质研究

为了获得一株饲用的高效降解赤霉烯酮(ZEN)的芽孢杆菌菌株,试验通过平板扩散法和酶联免疫法进行筛选,并对降解率较高的菌株进行种属鉴定、性质和产酶情况研究。结果表明:通过筛选共得到7株功能菌,其中菌株Y-1d的降解率最高,经菌落菌体形态、16S rDNA序列分析和生理生化鉴定确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);该菌株在p H值为4.5~6.5、温度为27~47℃的范围内生长良好,对胆盐有一定的耐受性,能够产生淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶。说明试验获得一株性质优良的可用于饲用的赤霉烯酮降解菌株。     

科技

正农科院饲料所成功构建新型羽毛降解工程菌近日,从中国农业科学院饲料研究所获悉,由该所姚斌研究员领衔的饲用酶工程创新团队通过筛选获得野生型快速羽毛降解菌株—解淀粉芽孢杆菌K11(Bacillus amyloliquefaciens K11),该菌株能在24小时内有效地将羽毛降解。     

多西环素降解菌的筛选、鉴定及发酵培养基优化

为了筛选鉴定能高效降解多西环素的菌株,并对其发酵培养基进行优化,试验对长期受四环素类抗生素污染的鸡粪等样品进行菌株富集,采用与多西环素共培养的方法进行初筛,用抑菌圈法和高效液相色谱法测定降解效率进行复筛来筛选菌株;经16S rDNA序列分析对降解率最高菌株的种属关系进行初步判定;通过正交试验设计对该菌株进行发酵培养基的优化,并计算培养基优化前后的降解率。结果表明:筛选得到1株对多西环素降解率较高的革兰氏阳性菌株D1,降解率为43.31%。经16S rDNA序列分析初步判定该菌株为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。对D1进行发酵培养基的优化,优化结果为可溶性淀粉0.75%、酵母浸粉0.5%、氯化钠0.25%、pH为7.0,发酵培养时间为48 h。优化后的降解率达到69.55%,比优化前提高了26.24%。     

枯草芽孢杆菌J530菌株的分离鉴定及其对鸡粪的氨减排作用

筛选出具有产脲酶抑制剂功能的芽孢杆菌菌株并验证其对鸡粪便氨减排的效果。采用以硫酸铵为唯一氮源的培养基,从鸡粪便中富集、分离高效利用氨氮的芽孢杆菌。利用尿素酚红培养基平板与尿素培养基摇瓶培养相结合,筛选不能利用尿素生长的菌株。通过比较各菌株发酵液对大豆脲酶的抑制率,获得对大豆脲酶抑制活性最高的菌株。分析该菌株的16SrRNA基因序列,观察其菌落菌体形态,测定其生理生化特征,以鉴定其种属。将该菌株以1.0×10⁷ CFU/g的接种量接入新鲜鸡粪,30℃静置5 d,评价对鸡粪中芽孢杆菌含量、脲酶活性、氨氮、尿素、尿酸含量、pH、氨气释放量的影响。结果表明,筛选到氨氮利用芽孢杆菌菌株共562个,其中氨氮利用率85%以上的菌株218个;初筛得到不产脲酶菌株23个;复筛得到对大豆脲酶活性抑制较强的菌株(抑制率>50%)6个,其中J530菌株抑制率达99.3%。经鉴定菌株J530为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株5d内可使鸡粪便中芽孢含量增加50.83倍(P<0.01),使鸡粪中脲酶的活性和氨氮含量分别降低83.86%(P<0.01)和44.41%(P<0.01),尿素含量和尿酸含量分别提高28.80%(P<0.05)和1.51%(P>0.05),pH降低1.15(P<0.05),5 d氨气释放量减少67.88%(P<0.01)。筛选得到了产脲酶抑制剂的枯草芽孢杆菌J530菌株,该菌株可显著降低鸡粪便氨排放。     

青贮用拮抗黄曲霉并降解黄曲霉毒素菌株的筛选与鉴定

为筛选一株用于青贮的拮抗黄曲霉且能够降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的芽孢杆菌菌株,本试验以香豆素为唯一碳源和能源进行菌株的初筛,以抑菌活性、AFB1降解率试验进行菌株的复筛。通过形态、生理生化特性以及16S r DNA序列分析对抑菌、毒素降解活性最好的菌株进行种属鉴定,并研究其对p H和温度的耐受性。结果表明:初筛获得45株能在以香豆素为唯一碳源和能源的培养基上生长的菌株,复筛发现N-1a对黄曲霉具有较强抑菌活性,对AFB1的降解率达到95%,并且对温度和pH具有良好的耐受性,最后鉴定N-1a菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

病死鸡尸体发酵堆肥中蛋白酶分解菌的分离鉴定及发酵工艺的研究

从鸡场病死鸡自然发酵堆肥中取样,分离筛选得到一株产蛋白酶活性高(揺瓶培养基酶活为2000U/ml)的菌株,经过鉴定,该菌株为解淀粉芽孢杆菌。本文通过不断优化该菌株的产芽孢培养基及其发酵工艺,最终确定了该菌在100～2000L发酵罐的发酵工艺,放罐芽孢数可达3.1×10~(10)CFU/ml,芽孢率≥98%。     

降解多种真菌毒素的芽孢杆菌的筛选鉴定及其发酵饲料应用

粮食作物在生长及其收获储存过程中,极易被有害真菌感染导致存在黄曲霉毒素（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）这3种真菌毒素污染,严重危害人和动物的健康。研究旨在筛选一种可以同时降解饲料原料中这3种真菌毒素的菌株,首次使用亚甲基蓝褪色作为降解真菌毒素筛选方法,再以过氧化物酶复筛最终获得一株蜡样芽孢杆菌BL-17,该菌株对AFB1、ZEN、DON 3种毒素同时存在的降解率分别达74.38%、98.31%和39.66%。后续将BL-17与两株乳酸菌混合对饲料原料进行发酵,在有氧条件下大幅度降解了饲料中这3种有毒物质,对AFB1、ZEN和DON的降解率分别高达86.72%、100%和43.19%。菌株BL-17不仅提高了发酵饲料的安全性,同时也可增加对非常规饲料原料的利用,具有很好的应用前景。