NLRP7基因在母源印记中的研究进展

NOD样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族在先天性免疫系统中行使着重要功能,与Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族相类似,该家族十分保守,不仅在植物中存在,也在哺乳动物体内表达。NLRs家族中有许多亚家族,其中,NLRP7(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein7)是NLRP亚家族中的一员,其在多种免疫细胞及免疫器官中表达,可参与细胞生长、增殖和分化过程,在细胞凋亡、炎症反应等生理过程中发挥作用。NLRP7除了在免疫系统中表达外,还在哺乳动物的睾丸、卵巢等生殖系统及早期胚胎中表达,NLRP7的突变通常会导致人类家族复发性葡萄胎疾病的发生,最终导致妊娠失败。近期研究发现,NLRP7是一种母源印记基因,NLRP7异常的印记状态导致了异常的胚胎发育。在猪、牛、羊等大动物中虽然尚未发现葡萄胎疾病,但许多不明原因的流产、死胎等均可能与NLRP7的突变有关。由于进化过程中NLRP7在小鼠等啮齿动物中发生了退化,因此目前有关NLRP7的研究以灵长类为主。作者就近年来NLRP7基因与动物生殖相关的研究进展进行了综述,以期为哺乳动物繁殖障碍等疾病的研究提供参考。     

NLRP7基因在母源印记中的研究进展

NOD样受体（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）家族在先天性免疫系统中行使着重要功能，与Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）家族相类似，该家族十分保守，不仅在植物中存在，也在哺乳动物体内表达。NLRs家族中有许多亚家族，其中，NLRP7（NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 7）是NLRP亚家族中的一员，其在多种免疫细胞及免疫器官中表达，可参与细胞生长、增殖和分化过程，在细胞凋亡、炎症反应等生理过程中发挥作用。NLRP7除了在免疫系统中表达外，还在哺乳动物的睾丸、卵巢等生殖系统及早期胚胎中表达，NLRP7的突变通常会导致人类家族复发性葡萄胎疾病的发生，最终导致妊娠失败。近期研究发现，NLRP7是一种母源印记基因，NLRP7异常的印记状态导致了异常的胚胎发育。在猪、牛、羊等大动物中虽然尚未发现葡萄胎疾病，但许多不明原因的流产、死胎等均可能与NLRP7的突变有关。由于进化过程中NLRP7在小鼠等啮齿动物中发生了退化，因此目前有关NLRP7的研究以灵长类为主。作者就近年来NLRP7基因与动物生殖相关的研究进展进行了综述，以期为哺乳动物繁殖障碍等疾病的研究提供参考。     

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NLRP3。以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。通过反应条件优化,成功建立了检测NLRP3基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示,所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因,建立的实时荧光定量PCR对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好,标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系。与对照组相比,NLRP3分子在FAdV-4感染鸡肝和脾中的转录水平极显著高于对照组(P0.001),在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组(P0.01)。本研究所建立的鸡NLRP3基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可以检测FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3的转录水平;致病性FAdV-4感染所造成的组织炎症损伤与NLRP3分子密切相关。     

布鲁氏菌LPS对小鼠巨噬细胞中NLRP3炎症小体转录水平的影响

为研究布鲁氏菌LPS对巨噬细胞中NLRP3炎症小体的影响,本试验提取布鲁氏菌2308、RB51和△WbkA的LPS,以不同浓度与小鼠巨噬细胞相互作用,荧光定量PCR检测其对NLRP3、ASC、Caspase1、IL1-β、IL18转录水平的影响。结果显示RB51LPS和△WbkA LPS上调NLRP3炎症小体相关基因的转录水平,且呈浓度依赖性,而浓度对2308LPS调节NLRP3炎症小体相关基因转录的作用不大;且同一浓度下,RB51LPS和2308LPS比△WbkA LPS更好的调节Caspase1、IL1-β、IL18的转录水平。     

NLRP3在介导小鼠皮肤伤口修复过程中的作用

本试验进行了小鼠肌成纤维细胞及骨髓源巨噬细胞的体外培养,随后使用野生型C57BL/6J小鼠或NLRP3基因敲除鼠耳皮肤肌成纤维细胞培养上清液(myofibroblast conditioned medium, MFbCM)处理M1和M2型巨噬细胞,分别检测巨噬细胞组织修复相关极化调节分子精氨酸酶(Arginase)的活性、NO的表达量、IL-10的分泌量以及几丁质酶3样分子(Ym1)的表达。同时,通过野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3基因敲除小鼠背部创伤模型的建立,分析皮肤伤口愈合情况。通过免疫荧光检测小鼠皮肤创面组织中Ym1和Arginase表达量。结果显示,在MFbCM诱导的条件下,骨髓源巨噬细胞的精氨酸酶活性、NO的表达、IL-10的分泌和Ym1的表达均依赖于小鼠肌成纤维细胞NLRP3的表达;当肌成纤维细胞NLRP3表达缺失后,巨噬细胞上述组织修复相关极化调节因子均出现下调现象,进而可能对伤口愈合产生不利影响。此外,与之相一致的是,NLRP3基因敲除小鼠的伤口愈合速度相比于野生型C57BL/6J小鼠显著缓慢。在创面组织中,NLRP3缺失后Ym1和Arginase表达显著下调。...     

犬流感病毒诱导的Beagle犬NLRP3炎性小体相关基因表达谱

炎症反应是机体对抗异物的一种先天性免疫反应,NLRP3(nod-like receptor family, pyrin domain-containing 3)炎症小体途径是炎症反应的主要途径之一,在机体对抗病原微生物反应中起着重要的作用。为了深入研究犬的NLRP3炎症小体在犬感染H3N2犬流感病毒(CIV)后的变化,对未感染以及感染H3N2 CIV早期(3 d)和后期(7 d)的比格犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、气管和淋巴结组织进行病理学检测。结果发现,感染H3N2 CIV的比格犬,在早期没有明显的病理变化,炎症反应不明显,但后期炎症反应明显增强。通过荧光定量PCR检测比格犬感染H3N2 CIV后NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α等炎症相关基因的转录水平,发现宿主在感染CIV早期炎症相关基因转录水平显著降低,而在感染H3N2 CIV后期的炎症相关基因转录水平比早期显著升高。进一步克隆犬NLRP3、ASC和Caspase-1基因并进行原核表达,制备多克隆抗体,通过免疫组织化学方法对未感染以及感染H3N2 CIV早期和后期的比格犬组...     

鸡小肠上皮细胞分离培养及NLRP3在该细胞中的表达

为了探明NLRP3在鸡小肠上皮细胞中表达情况,为鸡的NLRP3基因在小肠细胞中的功能研究奠定基础。采用18胚龄的鸡胚,分离培养鸡的小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC);采用免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)和反转录PCR(RT-PCR)方法,检测NLRP3基因在鸡小肠上皮细胞中的表达。结果表明:分离培养出活性较强的IEC;ICC检测显示获得的小肠上皮细胞表面NLRP3抗原阳性,RT-PCR法可扩增出520 bp的目的片段。表明成功分离培养出鸡小肠上皮细胞,并证明鸡NLRP3在鸡小肠上皮细胞中表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA刺激下NLRP3与DDX19A共定位的研究

NLRP3蛋白为核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLRs)家族中含有脓素(Pyrin)结构域3的蛋白,它能够与调亡相关斑点样蛋白(ASC)以及半胱氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)组成炎性小体复合物,切割pro-IL-1β和pro-IL-18使其成为成熟的IL-1β和IL-18参与炎性反应。猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的RNA能够被DDX19A解旋酶识别并激活NLRP3炎性小体,诱导炎症反应。为研究PRRSV RNA激活NLRP3炎症小体后DDX19A与NLRP3的亚细胞定位情况,本研究以PRRSV Hu N4株感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的总RNA制备的c DNA为模板,扩增了猪nlrp3基因。将其在原核细胞中表达,并采用表达的NLRP3免疫BALB/c小鼠制备了鼠源抗NLRP3多克隆抗体。此外,提取PRRSV的RNA,转染于PAMs中,36 h后分别采用抗DDX19A和抗NLRP3的多克隆抗体进行检测,激光共聚焦试验结果显示:未转染PRRSV RNA的细胞中,DDX19A和NLRP3在PAMs中呈弥散表达,无共定位现象出现,而在转染PRRSV RNA的PAMs中DDX19A和NLRP3在细胞质中呈点状分布并出现共定位现象。本研究为阐明PRRSV感染激活NLRP3炎性小体的分子机制奠定了基础。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列(GenBank登录号:XM_003124236.4)设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。