Cofilin在鸭肠炎病毒感染过程中的影响

为了解Cofilin在鸭肠炎病毒（DEV）感染过程中的作用及DEV致病机制。以受精鸭蛋、鸭肠炎病毒GZ株为主要研究对象,根据测序获得鸭源-Cofilin2全基因序列,提取和筛选Cofilin2-shRAN,利用FQ-PCR对细胞Cofilin基因转录水平进行测定,分析Cofilin基因的RNAi对DEV的影响。DEF细胞转染处理过程中,转染成功的干扰质粒共有4个,其中Cofilin2-shRAN-86沉默效益最高,可促进DEV的增殖效果。     

靶向cofilin2基因RNAi对鸭病毒性肠炎病毒增殖的影响

旨在探讨cofilin2基因的表达在鸭病毒性肠炎病毒(DEV)增殖过程中的影响.本研究通过已获得的鸭源cofilin2全基因序列(GenBank登录号:MF434775),设计出4对shRNA序列,插入载体中,并转染到鸭胚成纤维细胞中,经FQ-PCR方法和荧光显微镜观察筛选出具有较高干扰效率的shRNA序列,用干扰效率...     

鸭病毒性肠炎病毒强毒在人工感染鸭体内形态结构和发生学的电镜观察

为研究鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CH强毒株在感染鸭体内的分布和形态学发生规律，应用透射电镜和超薄切片技术对人工感染DEV的成年鸭各组织器官进行观察。结果表明：感染后12h在脾脏和法氏囊首先观察到少量的DEV出现，24h后在脾、胸腺和法氏囊以及死亡鸭的肝、肠和胰中均观察到具有典型的疱疹病毒粒子及其核衣壳形态的DEV。DEV病毒核衣壳有空心型、致密核心型、双环型和内壁附有颗粒型4种形态，存在胞核和胞浆两种装配方式。病毒成熟有两种方式：一为细胞核内核衣壳在核内获得皮层，通过核内膜获得囊膜成为成熟病毒；二为核内核衣壳通过内外核膜进入胞浆，核内和胞浆内的核衣壳在细胞浆中获得皮层，然后在各种质膜上获得囊膜，最后成熟病毒通过细胞破裂或其他方式释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟，细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密颗粒、核内微管和中空短管、胞浆电子致密小体等结构。     

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构观察

通过超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒（DEV）CH强毒株在鸭胚成纤维细胞（DEF）中的形态结构进行了研究。结果发现，DEVCH强毒株病毒核酸呈圆形颗粒状，直径35～45nm，在胞核内常集中分布；病毒核衣壳呈圆形．直径90～100nm．在胞核和胞浆内都有分布；DEV核衣壳可根据所含核酸形态的差异分为空心核衣壳、内壁附有颗粒型核衣壳、同心圆形核衣壳和实心核衣壳；成熟的病毒粒子具有囊膜和皮层结构．呈圆形．直径150～300nm，存在于胞浆空泡内；DEV可在DEF中分别形成胞浆内和胞核内包涵体结构；伴随子代病毒在细胞内的出现，胞浆内迁出现豆英状、马蹄形、半圆形、圆形、同心圆形等与病毒发生有关的电子致密结构。     

鸭肠炎病毒gD蛋白亚细胞定位及其对病毒感染相关作用分析

本试验旨在研究鸭肠炎病毒(DEV)gD蛋白亚细胞定位及其对病毒感染的相关作用.本研究经过对DEV病毒扩增处理,利用原核表达系统获得重组gD基因胞外区蛋白(gDw),以兔抗gDw IgG为抗体,进行免疫荧光反应,对比病毒对照组,检查gD蛋白在吸附、侵入以及传播之间起到的作用.结果表明,经过荧光显微镜观察,接种DEV后4h...     

蛋白激酶C抑制剂及激活剂对鸭肠炎病毒增殖的影响

为进一步探究鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)的致病机理,试验采用鸭蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的抑制剂星形孢菌素(staurosporine,SP)和激活剂佛波醇(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)研究PKC/PKCI能否对DEV的增殖产生影响,为阐述DEV致病机理提供新的思路。用SP/PMA处理正常鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast,DEF)后,实时荧光定量PCR方法检测不同时间段PKC/PKCI基因表达;用DEV病毒液感染SP/PMA处理的DEF后,收集不同时间段培养物,以Reed-Muench法计算DEV半数组织培养感染量(TCID50)值,实时荧光定量PCR方法检测分析DEV NP基因转录水平。结果显示,SP处理对宿主细胞PKC/PKCI基因表达水平无显著影响(P0.05);而PMA处理可极显著提高宿主细胞PKC基因表达(P0.01),但对PKCI基因表达水平无显著影响(P0.05);SP/PMA处理对DEV复制能力影响显著(P0.05;P0.01),且在感染前期可显著或极显著降低DEV NP基因的转录水平(P0.05;P0.01)。综上所述,SP和PMA对PKC、PKCI基因表达水平的影响效果不同,且都能有效抑制DEV增殖,本试验结果可为DEV的防控及其致病机理的研究提供基础资料。     

蛋白激酶C抑制剂及激活剂对鸭肠炎病毒增殖的影响

为进一步探究鸭肠炎病毒（duck enteritis virus，DEV）的致病机理，试验采用鸭蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）的抑制剂星形孢菌素（staurosporine，SP）和激活剂佛波醇（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）研究PKC/PKCI能否对DEV的增殖产生影响，为阐述DEV致病机理提供新的思路。用SP/PMA处理正常鸭胚成纤维细胞（duck embryo fibroblast，DEF）后，实时荧光定量PCR方法检测不同时间段PKC/PKCI基因表达；用DEV病毒液感染SP/PMA处理的DEF后，收集不同时间段培养物，以Reed-Muench法计算DEV半数组织培养感染量（TCID₅₀）值，实时荧光定量PCR方法检测分析DEV NP基因转录水平。结果显示，SP处理对宿主细胞PKC/PKCI基因表达水平无显著影响（P>0.05）；而PMA处理可极显著提高宿主细胞PKC基因表达（P<0.01），但对PKCI基因表达水平无显著影响（P>0.05）；SP/PMA处理对DEV复制能力影响显著（P<0.05；P<0.01），且在感染前期可显著或极显著降低DEV NP基因的转录水平（P<0.05；P<0.01）。综上所述，SP和PMA对PKC、PKCI基因表达水平的影响效果不同，且都能有效抑制DEV增殖，本试验结果可为DEV的防控及其致病机理的研究提供基础资料。     

鸭肠炎病毒gD基因胞外区的原核表达及在感染鸭胚成纤维细胞中的定位

以本实验室获得的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株US区基因序列(GenBank登录号EU714267)为基础PCR扩增出gD基因胞外区(gDw),将其定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)并转化至大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLys。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明gD基因胞外区在大肠杆菌中获得与预期大小相符的表达蛋白。重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,血清琼扩效价达1∶16,噬斑减数中和试验测定血清中和抗体效价达1∶64。通过免疫荧光技术首次对gD进行亚细胞定位检测,结果表明DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后4h近核区域细胞质内首先开始出现荧光,12h以后显著增加,明显的点状绿色荧光广泛存在于胞质中。本研究为进一步开展DEV gD的功能研究提供了重要数据和材料。     

鸭肠炎病毒UL18基因的转录、表达特征及原核表达蛋白的初步应用

为了探讨鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)UL18基因的特性和功能,本研究运用生物信息学软件对DEV UL18基因及其编码蛋白进行了分析。构建原核表达质粒pET32a-UL18,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得了大小约为55 000的pET32a/DEV-UL18重组蛋白。将该重组蛋白纯化后免疫家兔,获得了兔抗pET32a/DEV-UL18重组蛋白高免血清。采用荧光定量RT-PCR和Western blot对DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后UL18基因的转录和表达情况进行检测,采用间接免疫荧光对DEV感染鸭的肠道和食道进行检测。生物信息学分析结果表明,DEV UL18基因大小969bp,编码1条由322个氨基酸残基组成的多肽,含15个潜在的磷酸化位点和2个N-糖基化位点,含15个潜在的B细胞表位;系统进化树分析表明,DEV UL18属于ɑ-疱疹病毒的1个成员,与MeHV-1亲缘关系最近;密码子偏爱性分析结果表明,若对DEV UL18基因进行外源表达,真核表达系统可能更容易,若选择原核表达系统,则需对宿主表达菌进行选择和条件优化。荧光定量RT-PCR和Western blot结果表明,DEV感染DEF后2h,UL18基因开始转录,感染后12h开始表达,感染24h后转录和表达产物急剧上升,到36和48h后转录和表达产物分别达最大值,之后逐渐下降。间接免疫荧光结果表明,被DEV感染鸭肠道、食道等组织能检测到明显的阳性信号,表明制备的DEV UL18原核表达蛋白及其兔抗多克隆抗体可用于DEV的诊断试剂材料。     

TK基因缺失对鸭肠炎病毒在鸡胚成纤维细胞中复制影响的评价

为鉴定鸭肠炎病毒(DEV)的非必需基因,本研究利用增强型绿色蛋白(EGFP)基因为报告基因,通过在转染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组,将其插入DEV基因组的TK基因中,经筛选和纯化绿色荧光病毒蚀斑,获得表达EGFP的重组DEV,命名为r DEVTK-EGFP。对重组病毒与亲本病毒DEV Clone-03复制动力学比较结果显示,重组病毒滴度显著低于亲本病毒(p0.01)。对重组病毒在复制过程中感染细胞能力和荧光表达时相检测结果表明,在感染后48 h~72 h表达荧光信号细胞明显增多,该结果与重组病毒复制动力学一致。将重组病毒在CEF中连续传代至20代,仍具有遗传稳定性。该研究结果表明,TK基因为DEV复制非必需基因,可以作为外源基因插入位点,用于禽用新型基因工程疫苗的研制。     

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株在鸭胚成纤维细胞中形态发生学的研究

采用超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株（DEV-CHv）在鸭胚成纤维细胞（DEF）中的形态发生学进行了研究。结果表明，DEV-CHv吸附到DEF细胞上以后通过囊膜和细胞膜间发生融合的方式侵入宿主细胞；病毒在细胞核内完成病毒核酸的生成、核酸与衣壳的装配；病毒核衣壳通过核膜-内质网膜系统从细胞核转运到内质网池中并在内质网池中得到皮层结构；获得了皮层的DEV-CHv核衣壳通过出芽方式释放到细胞空泡内得到囊膜结构后成为成熟病毒；细胞空泡内的成熟DEV-CHv可通过细胞的胞吐作用被释放到细胞外，或在空泡破裂时被释放到细胞外。     

NF-κB信号通路激活剂LPS/抑制剂SN50对鸭肠炎病毒增殖影响的研究

为探究NF-κB信号通路对鸭肠炎病毒(DEV)增殖的影响,本实验分别以不同终浓度的NF-κB信号通路激活剂LPS(2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)和抑制剂SN50(25.0μg/mL、50.0μg/mL、75.0μg/mL)处理鸭胚成纤维(DEF)细胞后,采用CCK8法分析LPS或SN50对DEF...     

鸭肠炎病毒UL41基因缺失株的构建及其体外增殖能力分析

旨在构建鸭肠炎病毒（DEV）UL41基因缺失毒株,并对其生物学特性进行分析,本研究以克隆有DEV UL41基因的重组黏粒D1为骨架,利用Red/ET重组技术构建缺失UL41基因的重组黏粒D1 dUL41;将UL41基因缺失重组黏粒D1 dUL41与其他4个克隆有DEV基因组片段的亲本黏粒共转染鸭胚成纤维细胞（DEF）,拯救获得UL41基因缺失毒株rDEV-SD19/dUL41。将该基因缺失病毒感染DEF后,提取病毒基因组进行PCR鉴定及测序,并利用间接免疫荧光试验检测该病毒感染细胞中UL41基因表达情况;绘制拯救的基因缺失病毒的生长曲线,分析其体外复制特性。PCR及测序结果显示,本研究成功构建了缺失UL41基因的重组黏粒D1 dUL41。将该基因缺失黏粒与其他含有DEV基因组的亲本黏粒共转染DEF后能够产生典型的蚀斑病变。PCR及测序结果显示,UL41基因成功从DEV基因组中缺失;间接免疫荧光试验发现,基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41感染DEF后,未见UL41蛋白表达。综上表明,本研究成功构建了DEV UL41基因缺失病毒。体外生长曲线显示,rDEV-SD19/dUL41在DEF中的复制能力明显低于亲本病毒,提示UL41蛋白在DEV复制中发挥重要作用。UL41基因缺失DEV的构建为进一步研究UL41基因在DEV感染和致病中的作用机制奠定了基础。     

鸭瘟病毒疫苗株UL44.5和UL44基因间隔区作为复制非必需区的鉴定

为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中适合外源基因插入的复制非必需区,本研究利用本实验室前期建立的DEV疫苗株多片段拯救系统,结合E/T克隆技术、LR克隆技术将含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的目的片段,定向插入到含DEV基因组复制非必需区的粘粒中,该位点位于DEV基因组UL区的UL44.5和UL44之间,拯救获得了重组病毒(rDEV)。通过PCR和荧光显微镜鉴定该重组病毒。结果显示,经PCR扩增,r DEV可以扩增到预期目的片段,观察可见红色荧光,表明RFP基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果显示,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。将r DEV以105 TCID50的剂量免疫SPF鸭后,DEV攻毒保护试验结果显示,r DEV和亲本株DEV活疫苗对SPF鸭的保护效率均为100%。本研究筛选到DEV基因组中的一个可供外源基因插入的位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗研制提供依据。     

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株适应在鸭胚成纤维细胞上生长的研究

对分离自鸭体的鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)进行了适应在鸭胚成纤维细胞(DEF)上生长的研究。结果表明,DEV-CHv病死鸭肝脏悬液以绒毛尿囊腔途径经10日龄鸭胚连续传代2次,取尿囊液接种细胞的方法可获得适应DEF生长的DEV-CHv,而肝组织内病毒直接接种在DEF上则不生长。DEV-CHv刚适应DEF时以细胞变圆、折光度增强为病变特征,而适应DEF后以细胞脱落和形成圆形蚀斑为特征。适应DEF的DEV-CHv通常30h左右使细胞脱落,36h左右在细胞单层上形成蚀斑,48h时细胞病变可达80%以上。     

鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL~(-1)时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL~(-1);特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。     

鸭肠炎病毒强毒参考株在感染鸭体内的动态分布研究

为了研究鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）强毒株在感染鸭体内的动态分布规律,根据DEV的gD基因序列设计检测引物RT-gDF和RT-gDR,建立了特异性强、敏感性高、重复性好的检测DEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用已建立的方法,对DEV强毒参考株感染鸭的组织脏器进行了定量检测。结果显示,接种后6 h即可在所有受检组织中检测到DEV DNA,随着病程发展,DNA拷贝数持续升高,直至接种5 d后感染鸭全部死亡。其中结肠病毒DNA拷贝数为最高,达到1013.26 copies,法氏囊、肝脏和盲肠次之,约1012 copies。本研究证实了DEV强毒对感染鸭的免疫器官、神经组织和消化系统均具有广泛的嗜性。     

鸭病毒性肠炎病毒的提纯及其结构蛋白SDS-PAGE分析

将鸭病毒性肠炎病毒（DEV）分离株SC-1经鸭胚成纤维细胞培养增殖后，采用差速离心结合蔗糖不连续密度梯度离心法进行提纯，获得多量、纯净的完整病毒粒子。病毒粒子主要位于40％～50％蔗糖层交界处，电镜下可观察到DEV具有典型的疱疹病毒特征，完整病毒粒子由囊膜、衣壳和核芯3个部分组成，直径为170～190nm。将纯化的DEV粒子经SDS—PAGE分析，发现其结构蛋白由11种多肽组成，即VP1（190000）、VP2（136000）、VP3（106000）、VP4（88000）、VP5（75000）、VP6（68000）、VP7（56000）、VP8（48000）、VP9（42000）、VP10（38000）和VP11（32000）．其中VP1、VP2、VP3、VP6、VP8和VP9等6条蛋白区带的相对百分含量较高，约占病毒结构蛋白总量的89．04％，为DEV的主要结构多肽。     

靶向H、N基因siRNA对犬瘟热病毒在vero细胞中复制的抑制作用

以犬瘟热病毒(CDV)的核衣壳蛋白基因(N基因)和血凝素蛋白基因(H基因)作为靶基因,各设计并体外合成小干扰RNA,分别为N1、N2、N3和H1、H2、H3。将6对siRNA分别转染非洲绿猴肾细胞(Vero)并在转染后接种CDV,48h后通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光、TCID50、荧光定量PCR等方法对2组6个siRNA抑制CDV在Vero细胞中增殖的效果进行比较研究。结果显示,转染细胞感染CDV 48h后,6个siRNAs干扰组细胞出现的绿色荧光明显少于对照组,病毒感染滴度分别是对照组的1/293、1/11、1/29、1/83、1/302和1/90,6个干扰组的CDV基因拷贝数分别是对照组的12.96%、57.75%、23.47%、31.82%、12.82%、15.58%。结果表明,6对siRNAs均对CDV在Vero细胞中的复制具有不同程度的抑制作用,且以H2组抑制效率最高。     

鸭瘟病毒疫苗株基因组复制非必需区的筛选

为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中的复制非必需区,本研究在已建立的DEV疫苗株5粘粒拯救系统的基础上,利用转座子随机插入技术,将含eGFP表达框架的基因片段随机插入DEV US区,救获两株表达绿色荧光蛋白的重组DEV(rDEV-us7eGFP、rDEV-us8us1eGFP)。将两株重组病毒在鸡胚成纤维细胞中连续传至20代后,通过PCR、荧光表达鉴定分析,结果显示gfp基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果表明,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。攻毒保护实验结果表明,将rDEV-us7eGFP和rDEV-us8us1eGFP以10~5TCID_(50)的剂量免疫SPF鸭后,其对鸭瘟强毒攻击的保护效率与DEV疫苗株一致,均为100%。本研究成功筛选到DEV基因组中的两个可供外源基因插入的复制非必需区,分别位于us7基因内部及us8与us1基因之间,为以DEV为载体构建相关重组疫苗奠定了重要基础。