猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备猪δ冠状病毒（PDCoV）N蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于临床样品中PDCoV抗原的免疫组织化学（IHC）检测,本研究以原核表达的PDCo V N蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,基于纯化的N蛋白建立的间接ELISA方法筛选获得稳定分泌N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对单克隆抗体的免疫反应特异性、亚类进行系统鉴定。结果显示：通过3次亚克隆筛选获得8株可分泌PDCo V N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA和Western blot分析,证实制备的单克隆抗体均与猪δ冠状病毒反应,且不与猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）反应,特异性良好。单克隆抗体亚类鉴定结果表明,1A11、3C6、1E7、1E12株单克隆抗体属Ig G1型,4F3、2A3株单克隆抗体为Ig G2a型,3E4单克隆抗体为Ig M型,8株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用1A11单克隆抗体对PDCo V、PDEV、TGEV感染猪的空肠、回肠组织进行IHC检测,结果表明1A11能与感染PDCo V的组织发生特异性免疫反应,而不与感染PDEV和TGEV的组织发生...     

非洲猪瘟病毒pK205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

非洲猪瘟(ASF)传播对我国生猪养殖造成重大危害,开发用于ASF诊断产品已刻不容缓。本研究为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)pK205R蛋白单克隆抗体,构建了能表达ASFV pK205R蛋白的工程菌BL21/pET-pK205R。经IPTG诱导,可表达可溶性的pK205R蛋白。经SDS-PAGE检测,获得的蛋白大小为25 kDa左右。经Western blot鉴定,纯化后的蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应。以纯化的ASFV pK205R蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了12株针对ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体。经间接ELISA方法鉴定,单克隆抗体的效价均不低于1∶80 000。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1及IgG2b,轻链亚类均为κ。通过间接免疫荧光试验(IFA)测定12株单克隆抗体均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒存在交叉反应,且均能与ASFV反应。本研究为建立快速检测非洲猪瘟病毒感染的诊断方法奠定了基础。     

抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原,构建杂交瘤细胞株,制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后,按常规方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞,制备P32蛋白单克隆抗体,获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以纯化的PRRSV全病毒抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,并测定其免疫球蛋白亚类、效价和特异性。结果成功获得2株能稳定分泌抗PRRSVM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为3C3、3D2,经鉴定亚类均为IgG2a、kappa链。2株单克隆抗体腹水ELISA效价达105～107,IPMA效价达1:2560～1:10240,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒等无交叉反应。结论获得特异性针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体,为研究该病的快速诊断技术奠定基础。     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化(IHC)检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】纯化猪塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus, SVV)SVV-CH-HB2016毒株,并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。【方法】以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验(IFA)结合间接ELISA筛选阳性细胞株,制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性,并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响,最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。【结果】在蔗糖密度梯度为5%～45%(W/V)时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白,免疫小鼠血清抗体效价均达到了1∶12 800,成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western bl...     

非洲猪瘟病毒p11.5蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

为了制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p11.5蛋白的特异性单克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统,将密码子优化后的ASFV p11.5基因序列连接表达载体pET28a-SUMO,构建pET28a-SUMO-p11.5原核表达质粒,获得了可溶性的ASFV p11.5蛋白。经Western blot鉴定,重组ASFV p11.5蛋白可被ASFV标准阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的p11.5蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞法,制备了4株可稳定分泌抗ASFV p11.5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单克隆抗体重链亚类为IgG1,1株重链亚类为IgG2a,轻链亚类均为κ。采用p11.5蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价均不低于1∶102.4×10~4。经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,4株单克隆抗体,均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒发生交叉反应,但均能与ASFV反应,表明单克隆抗体具有良好的特异性和反应性。本试验为p11.5蛋白结构功能、免疫学特性及ASFV诊断试剂产品的研究提供了重要的生物材料。     

猪NLRP3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。     

猪轮状病毒VP6重组蛋白多克隆抗体与单克隆抗体间接免疫荧光试验的比较

用纯化的重组猪轮状病毒VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗血清,同时运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗猪轮状病毒VP6的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名C5D10。应用抗猪轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体和多克隆抗血清对感染猪轮状病毒的Marc-145细胞培养物进行了间接免疫荧光检测病原的比较研究。结果表明,利用所研制的抗猪轮状病毒VP6蛋白McAb进行间接免疫荧光法对病原检测具有很高的特异性。