猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

伪狂犬病毒单克隆抗体的制备和鉴定

以伪狂犬病毒（PRV）作为免疫原,免疫BALB／c小鼠,融合之后经间接ELISA、IFA和IHC试验进行杂交瘤筛选,共获得2株能分泌针对PRV单克隆抗体（简称单抗）的杂交瘤细胞株。2株猪伪狂犬病毒单抗与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒均无交叉反应,IFA结果显示单抗能与接种于猪睾丸细胞（ST）的PRV发生特异性反应,IHC结果显示单抗能用感染了PRV的猪神经组织发生反应,证实抗PRV单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性,此结论为猪伪狂犬病毒抗原表位分析及相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

分泌抗猪伪狂犬病毒(鄂A株)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将本室分离鉴定的猪伪狂犬病毒（Ｐｒｖ）鄂Ａ株纯化后免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取免疫鼠脾细胞与经８氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）驯化的ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合。经间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）筛选,挑选强阳性孔进行亚克隆,获得５株能稳定分泌伪狂犬病毒单克隆抗体（Ｐｒｖ－ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株,分别命名为４１８、４８３、５７６、６０３、７４４。经体外连续传代及反复冻存、复苏,杂交瘤细胞均能稳体地分泌ＭｃＡｂ。培养上清液及小鼠腹水ＥＬＩＳＡ效价分别为２－５～２－７和１０－５～１０－１０。各株分泌的ＭｃＡｂ不与疱疹病毒科中的ＤＰＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＲＶ及ＰＰＶ发生交叉反应。阻断试验结果显示阻断率均大于５０％。其中６０３、７４４分泌的ＭｃＡｂ对用ＰＲＶ致敏的乳胶具有凝集特性。相加ＥＬＩＳＡ测定证实６０３、４８３、７４４特异性作用同一抗原位点或作用相关极为密切的抗原位点,另４种ＭｃＡｂ作用位点有部分相关性。     

分泌抗猪伪狂犬病病毒(北京株)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用纯化的猪伪狂犬病病毒免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合 ,经间接ＥＬＩＳＡ筛选,３次有限稀释法克隆,获得了２株能稳定分泌抗伪狂犬病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株１Ｈ７和３Ｂ５,经鉴定两株单抗均为ＩｇＧ１亚类、Ｋａｐｐａ型轻链,杂交瘤细胞的平均染色体数为９７,细胞培养液上清及腹水效价分别为１：１０２４、１：１０２４和１：１０＾８、１：１０＾７;１Ｈ７、３Ｂ５单克隆抗体不与猪繁殖－呼吸综合征病毒、猪温病毒、猪细小病毒发生交叉反应,显示良好的特异性,为进一步应用奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒分离和鉴定

从病猪肾脏分离到1株病毒.该病毒接种Balb/c小鼠出现神经症状,死亡率为50%,接种Vero出现拉网病变;伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)阳性血清能特异中和该分离毒;根据基因库(genebank)的PRV gD基因(AY169694)设计的引物能扩增出特异性片段.以上结果证实该病毒为伪狂犬病毒.     

猪伪狂犬病毒的分离和鉴定

从病猪肾脏分离到1株病毒.该病毒接种的Balb/c小鼠出现神经症状,死亡率为60%,接种PK-15细胞出现拉网病变,猪的狂犬病毒阳性血清能特异性的中和该分离毒.根据基因库(genebank)的PRV gE基因设计的引物能扩增出特异性片段,结果证实该病毒为伪狂犬病毒.     

猪伪狂犬病毒DQ株的分离鉴定与生物学特性研究

从黑龙江省大庆市某猪场采集流产的仔猪脑组织、扁桃体等病料接种BHK-21细胞,分离到1株病毒,用PCR法、血清中和试验及直接免疫荧光法等方法进行鉴定,并对病毒滴度、对兔和15日龄仔猪的致病力、对热、胰蛋白酶、氯仿以及乙醚的敏感性等生物学特性进行测定.结果表明:PCR法能扩增出217 bp的基因片段,与预期目的条带一致;病毒能被伪狂犬病毒阳性血清所中和,直接免疫荧光法结果呈阳性;经克隆纯化后测定其病毒滴度为107.36 TCID50/0.1 mL,对兔和15日龄仔猪有较强的致病力,对热、胰蛋白酶、氯仿、乙醚敏感.鉴定结果表明,该病毒为猪伪狂犬病毒,命名为PRV DQ株.     

伪狂犬病毒SN株、SL株的分离鉴定

对琼扩试验检测为伪狂犬病毒 (PRV )阳性的病料 ,采用MDBK细胞进行病毒分离培养 ,获得了两株PRV ,进而经家兔接种和核酸杂交鉴定为PRV阳性 ,将其分别命名为PRVSN株、SL株。     

一例猪伪狂犬病毒的分离和鉴定

从病猪肾脏分离到1株病毒,该病毒接种Palb/c小鼠出现神经症状,死亡率为60%,接种PK-15细胞出现拉网病变,阳性血清能特异性的中和该分离病毒,根据基因库(genebank)的PRVgE基因设计的引物能扩增出特异性片段。以上结果证实该病毒为伪狂犬病毒。     

猪伪狂犬病毒DQ株的分离鉴定和生物学特性的研究

从黑龙江大庆某猪场采集流产死亡的仔猪大脑、扁桃体等病料组织接种BHK-21细胞,分离到1株病毒,经PCR检测、直接荧光法检测,血清中和试验,证实分离到的病毒为伪狂犬病毒,命名为PRV DQ株,该病毒经克隆纯化后测得其毒价为108.36TCID50/ml,对热、胰蛋白酶、氯仿、乙醚敏感,15日龄哺乳仔猪接种该分离株后发病死亡。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株gE和gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗免疫抗体与病毒感染抗体鉴别诊断方法,分别以PRV变异毒株的gE或gB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选所需单克隆抗体,获得6株抗PRV gE蛋白的单抗(3E6、7E1、7C5、10C3、15C1、14C1)和6株抗PRV gB蛋白的单抗(1C1、5D2、2F11、5G8、10C7、8H5)。IPMA检测结果显示,gE蛋白单抗能识别PRV变异毒株,但不识别疫苗株;而gB蛋白单抗可同时识别PRV变异毒株和疫苗株。gE单抗10C3和gB单抗10C7的ELISA效价和IPMA效价均分别达1∶5×10~(5.0)和1∶8×10~(3.0)以上。所筛选出的单抗均不与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)等其他常见病毒发生交叉反应。gE蛋白和gB蛋白的表达及单抗的制备为PRV感染抗体与疫苗免疫抗体鉴别诊断(DIVA)试纸的研发奠定基础。     

猪源脑心肌炎病毒单克隆抗体研制与免疫学特性测定

利用纯化灭活的猪源脑心肌炎病毒(EMCV)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,研制获得4株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D1、2A2、2B6和4E2。经ELISA测定,细胞培养上清中抗体效价分别为1∶1 600,1∶6 400,1∶6 400和1∶3 200,小鼠腹水抗体效价分别为1∶1.63×106,1∶3.28×106,1∶1.13×106和1∶5.63×105。1D1和2A2单抗亚类为IgG1,2B6和4E2单抗亚类为IgG2b,轻链均为κ型。Western blot结果表明,1D1、2A2和4E2能特异性识别病毒的VP1蛋白,2B6能特异性识别病毒的VP2蛋白。间接免疫荧光试验证明,4株单抗具有良好的特异性,均能识别EMCV。本研究获得的4株特异性单抗,将为EMCV诊断方法的建立和病毒蛋白功能的研究奠定基础。     

日本脑炎病毒囊膜蛋白单克隆抗体的制备及特性分析

将日本脑炎病毒(JEV)囊膜蛋白Cap-ED3重组蛋白免疫BALB/c雌鼠,应用细胞融合技术制备单克隆抗体,经ELISA筛选获得4株稳定分泌识别JEV ED3蛋白单抗的杂交瘤细胞,命名为1B10、3F5、4H1和5F9。这4株单抗在Western blot和间接免疫荧光试验中均能特异识别JEV NJ2008株。制备4株单抗的小鼠腹水,5F9效价最高,为1∶409 600。空斑减少中和试验结果表明:4株单抗均没有中和活性。相加ELISA试验表明:4株单抗中3F5和4H1识别相同抗原表位,1B10、5F9分别识别其他的抗原表位,且差异较大。应用鸭坦布苏病毒(DTMUV)特异性抗原进行ELISA检测的结果表明:5F9识别的表位与DTMUV有交叉,其他3株识别的抗原表位与DTMUV无交叉。本研究获得了3株JEV囊膜蛋白特异性的单抗和1株识别JEV和DTMUV交叉抗原表位的单抗,为JEV抗原和抗体检测试剂盒的研制提供了良好的物质基础。     

Production and characterization of two serotype independent monoclonal antibodies against foot-and-mouth disease virus

Two foot-and-mouth disease virus (FMDV) monoclonal antibodies (mAbs) were produced from mice immunized with either FMDV serotype A, subunit (12S) or FMDV serotype O, whole virus (140S). Both mAbs (F1412SA and F21140SO) recognized all seven serotypes of FMDV in a double antibody sandwich (DAS) ELISA, suggesting that the binding epitopes of the two mAbs are conserved between serotypes. These mAbs are IgG1 isotype and contain kappa light chains. In order to define the mAb binding epitopes, the reactivity of these mAbs against trypsin-treated and denatured FMDV were examined using an indirect ELISA. The binding site of the mAb, F1412SA is trypsin sensitive and the epitope is linear. Both ELISA and Western blot results suggested that the polypeptide VP2 contributed to the immunodominant site. This mAb showed reactivity to VP2 peptide (DKKTEETTILEDRIL). The mAb, F21140SO, recognized an epitope which is trypsin resistant and discontinuous. This mAb binding to FMDV is dependent on conformational structures of intact viral (140S) or subunit (12S) particle, since it failed to recognize any viral protein in Western blot. This conformational and highly conserved epitope is the first identified epitope among all seven FMDV serotypes. Because the use of mAbs increases the specificity, accuracy and efficiency of diagnostic tests compared to polyclonal antisera, these two mAbs with different specificities are suitable for type-independent diagnosis of FMDV, such as DAS ELISA, or could be adapted to immuno-chromatographic or flow-through rapid test.     

抗金玉兰酶制剂(β-内酰胺酶)单克隆抗体的研制与特性分析

以金玉兰酶制剂(β-内酰胺酶)为抗原,制备出16株能稳定分泌抗β-内酰胺酶特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株.对其中的高效价单克隆抗体进行了特性和表位分析,结果显示,抗原金玉兰酶制剂分子表面至少有两个相同或相近的表位,且它们的距离较远,采用4F11、2H5或1B10中的任一株单抗,就能实现对β-内酰胺酶的双抗夹心ELISA检测;4F11、2H5和1B10的免疫球蛋白亚型鉴定都是IgG1,亲和力常数在1×107L/mol～1×1010L/mol之间;4F11的检测灵敏度为19 ng/mL.证实该3株单克隆抗体可用于研制检测牛奶中金玉兰酶制剂的免疫学试剂盒.     

抗鹅γ-干扰素单克隆抗体的制备及鉴定

IFN-γ也称免疫IFN,主要由CD4+ Th1细胞、CD8+T细胞和NK细胞产生,是体内具有抗病毒和免疫调节功能的重要细胞因子之一[1].IFN-γ不但具有抗病毒、抗肿瘤活性,也可作加强和改善机体 免疫应答的免疫佐剂,与病毒的保护性抗原基因共 表达可加强和改善机体免疫应答.在禽类IFN-γ的研究中,鸡、鸭等IFN-γ的相关性研究较深入,有 关鹅IFN-γ的研究报道较少[2-3].     

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

为制备基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。