噬菌体Bp7蛋白gp38的克隆、表达及其受体识别活性分析

为了研究噬菌体Bp7蛋白gp38在噬菌体吸附宿主菌过程中的作用,PCR扩增gp38基因,对gp38蛋白氨基酸序列特征进行分析和同源性比对,构建重组表达质粒pColdTF-gp38,在E.coli BL21中诱导表达,SDSPAGE电泳和Western blot检测重组蛋白gp38的表达;亲和层析法纯化蛋白,制备gp38多克隆抗体。免疫电镜检测gp38在噬菌体Bp7表面的定位,蛋白竞争试验和抗体阻断试验测定gp38及其抗体对噬菌体Bp7吸附效率的影响。序列分析结果表明,gp38蛋白氨基酸序列与T4噬菌体无同源性,与噬菌体T2、T6有同源性,C端序列保守区与高变区间隔排列,呈现马赛克特征;构建的重组质粒pColdTF-gp38在E.coli BL21实现可溶性表达,制备的gp38多克隆抗体效价达1∶16;免疫电镜检测结果表明,gp38蛋白抗体能够与长尾丝结合,引起噬菌体Bp7的聚集;蛋白竞争试验和抗体阻断试验结果表明gp38蛋白及其抗体均能完全抑制噬菌体Bp7对宿主菌E.coli K12的吸附。以上研究结果表明,gp38是噬菌体Bp7的尾丝蛋白,位于长尾丝末端,作为受体识别蛋白在噬菌体Bp7吸附宿主菌过程中具有关键作用,这为进一步阐明宽宿主谱噬菌体Bp7识别受体的机制提供了理论基础。     

分枝杆菌噬菌体CJAUS5株holin基因的克隆与序列分析

为了研究噬菌体裂解宿主菌的机制,开发噬菌体裂解相关蛋白的应用价值,试验参照Gen Bank中登录的holin基因序列设计特异性引物,以分枝杆菌噬菌体CJAUS5基因组为模板,经PCR扩增出411 bp的条带。构建重组质粒p MD19-T-holin,经双酶切鉴定呈阳性后进行测序分析。结果显示,克隆出的holin基因与已知分枝杆菌肌尾噬菌体holin序列同源性高达99.03%~99.51%;编码的氨基酸同源性高达99%~100%。对holin基因编码的蛋白进行分析表明,Holin蛋白具有亲水性C端和两个跨膜区域。研究成功克隆了分枝杆菌噬菌体CJAUS5的holin基因并进行了氨基酸序列分析,为进一步研究Holin蛋白的生物学特性及功能奠定了基础。     

多价噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的表达及其对噬菌体增殖的影响

为研究大肠杆菌多价噬菌体Bp7的尾丝蛋白gp37在噬菌体宿主识别中的作用,通过PCR扩增噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的C末端基因,构建原核重组表达质粒pGEX-6p-1-gp37,并转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达。以鉴定正确的融合表达蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并检测抗血清对噬菌体增殖作用的影响。结果显示:经SDS-PAGE及Western blot鉴定证实得到含有GST标签67ku的融合表达蛋白;抗Bp7尾丝蛋白gp37的抗血清可明显抑制噬菌体Bp3、Bp7的增殖(P<0.05),对噬菌体Bp2、Bp5、Bp6的增殖具有抑制作用,但差异不显著(P<0.05),该抗血清对噬菌体Bp4的增殖反而具有促进作用。试验结果证实gp37参与噬菌体Bp7的宿主识别。     

噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的原核表达与鉴定

为了研究噬菌体尾丝蛋白gp37在识别宿主菌大肠埃希菌K12过程中的作用,PCR扩增获得gp37基因C端1 161bp序列,以EGFP为荧光标签,构建重组表达质粒pET-28a-EGFP-gp37,在大肠埃希菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达重组蛋白EGFP-gp37,亲和层析纯化蛋白。SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,重组蛋白EGFP-gp37在大肠埃希菌BL21(DE3)为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白量的23%。EGFP-gp37融合蛋白与大肠埃希菌K12相互作用,激光共聚焦显微镜检测结果显示,尾丝蛋白gp37能够吸附到宿主菌K12表面,表明尾丝蛋白gp37参与宿主菌受体的识别和吸附过程。     

噬菌体Bp7耐受株K12-R生物学特性分析

宿主菌E.coli K12的突变株K12-R不能被噬菌体Bp7裂解,为了明确其产生耐受的原因以及突变对其生物学性能的影响,对K12-R进行全基因组测序,分析其产生耐受的原因,浊度测定K12-R的生长曲线和自凝能力,革兰染色检测K12-R生物膜的形成能力,比较K12-R和E.coli K12之间生物学性能的变化。结果表明,突变株K12-R脂多糖合成相关基因hldE发生了突变,突变株K12-R细胞膜通透性增加,生长繁殖能力降低,自凝能力增强,生物膜形成能力增强。E.coli K12的脂多糖合成基因hldE突变能够改变K12-R脂多糖的结构,从而抑制噬菌体Bp7的吸附。这为明确K12-R突变株对噬菌体Bp7的耐受机制研究提供了理论依据。     

噬菌体Bp7尾丝蛋白gp35、gp38对噬菌体增殖的影响

为了研究噬茵体尾丝蛋白gp35、gp38在噬菌体宿主识别中的作用,扩增并克隆gp35、gp38基因,分别构建重组表达质粒,得到重组融合蛋白后免疫家兔制备多克隆抗体,并检测不同的抗血清对噬菌体增殖的影响.结果显示,经SDS-PAGE及Western blot鉴定证实得到含有GST标签的67 000、53 000的gp35、gp38重组融合蛋白;抗噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38与gp35的抗血清均能明显抑制噬菌体Bp7的增殖,而其中gp38的抗血清更是能完全抑制Bp7增殖,证明gp35、gp38参与噬茵体Bp7的宿主识别过程.     

大肠杆菌噬菌体Bp7对鸡舍环境的消毒效果

为了解大肠杆菌噬菌体Bp7对鸡舍环境的消毒效果,探讨噬菌体作为养鸡场消毒剂的前景,采用双层平板法检测噬菌体对鸡致病性大肠杆菌的裂解情况;采用喷雾法检测实验室环境下噬菌体对宿主菌的消毒效果,并对鸡舍环境下噬菌体喷雾对鸡舍地面、粉尘、粪便及空气的消毒效果。结果表明:噬菌体Bp7能裂解40株致病性大肠杆菌中的14株,包括O78、O88、O23、O73等血清型;噬菌体喷雾30 min即可杀灭99%以上的宿主菌,并可显著降低鸡舍粉尘、地面及空气中的细菌总数及大肠菌群数。说明噬菌体Bp7可作为绿色消毒剂用于鸡舍环境消毒。     

噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38密码子用法及偏性分析

为了解噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38的密码子使用特征,利用生物信息学方法对1株临床分离的多价烈性噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38与其他5株T4类噬菌体进行密码子用法的分析比较。结果发现,Bp7尾丝蛋白gp38与其他5株T4类噬菌体密码子的使用模式差别大,Bp7尾丝蛋白gp38偏好于以C结尾的密码子,而其余5株噬菌体偏好A或U结尾;除了AUG(Met)和UGG(Trp)外,还确定了Bp7尾丝蛋白gp38使用的25种高频密码子;通过6株噬菌体gp38的密码子偏性比较发现,Bp7与任何一株噬菌体都存在较大差异;聚类分析的结果也表明,Bp7尾丝蛋白gp38与其余5株噬菌体不属于一类。总体上,噬菌体Bp7尾丝蛋白gp38在密码子使用上比较特殊,gp38基因密码子的分析将为进一步研究噬菌体Bp7的感染机制及扩宽其裂解谱奠定基础。     

猫白介素18基因的克隆、表达及其产物的生物学活性分析

白介素18(IL-18)可以诱导IFN-γ分泌,促进T、B淋巴细胞的增殖分化,具有良好的抗病毒活性。为探究猫IL-18的生物学活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)联合poly I:C共同刺激实验猫,采用常规方法分离猫脾淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法获得大小为579 bp的猫IL-18基因。构建了可溶性表达猫IL-18的重组大肠杆菌pCold-IL-18/BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果显示,重组菌表达了约70 ku的重组蛋白。重组蛋白经3C蛋白酶处理后并通过Ni柱亲和纯化,获得了可溶性表达的重组猫IL-18(rIL-18)。取BALB/c小鼠和猫的脾淋巴细胞,经不同浓度rIL-18刺激,采用MTT法检测rIL-18促进淋巴细胞增殖活性,结果显示可溶性表达的rIL-18能够有效地促进淋巴细胞增殖;采用细胞病变抑制法检测rIL-18协同干扰素的抗病毒效果,结果显示rIL-18联合临床用干扰素可显著增强抗病毒效果。本研究为治疗猫病毒性疾病奠定了物质基础。     

牦牛BMP7基因的克隆及其在发情期卵巢、子宫的表达分析

为探究牦牛骨形态发生蛋白(Bone morphogentic protein 7,BMP7)生物学特性和对雌性牦牛生殖生理的调控作用。研究基于牦牛BMP7基因(NW＿005392954.1)设计引物,以发情期牦牛的卵巢、子宫的cDNA为模板进行扩增,借助DNAMAN 8.0等软件、NCBI等网站对扩增产物进行生物信息学分析。通过western blot和qRT-PCR对牦牛的卵巢、子宫的BMP7蛋白和mRNA进行定量分析,结果表明：扩增的BMP7基因为428 bp,编码142个氨基酸,其基因序列与水牛、奶牛和山羊等反刍动物的同源性均可达到98.59%,且在0～29位氨基酸存在信号肽,属于分泌型蛋白。western blot和qRT-PCR结果显示发情期卵巢表达量显著高于子宫(P<0.05)。研究结果表明,BMP7可能参与调控牦牛的繁殖性能,为牦牛在高压低氧环境下生殖生理机制方面的研究提供参考。     

猫干扰素基因的克隆表达及其活性测定

根据已知人、马、牛、羊、兔、鹿等物种体内IFNω的基因序列分析,设计引物进行扩增。将扩增基因克隆于原核表达载体pET-His。将重组表达载体转入宿主菌进行诱导表达,表达产物以包涵体的形式存在,大小约为20kDa,表达量达到28%。将表达产物复性纯化处理后加入猫肾上皮细胞(CRFK),用水泡性口炎病毒(VSV)攻毒,测出重组IFNω的生物活性达到1.64×106U/mg,重组蛋白质的含量约为18mg/L。     

绵羊Nanog启动子克隆及其表达活性的检测

通过比对人、鼠、兔和牛的Nanog启动子保守区设计引物,PCR扩增绵羊Nanog基因启动子序列并分析其调控位点。将其连接到去掉自身CMV启动子的pAcGFP1-N1载体上,构建一个由Nanog启动子带动的真核表达载体(SNanog-pAcGFP1-N1),即构建一个能由该启动子序列带动并产生绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体,并用脂质体法转染入终末分化细胞(小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞)、胚胎干细胞和小鼠胚胎,检测其表达活性。结果显示:成功克隆出1 836bp Nanog启动子序列,通过分析发现该序列含有SP1结合位点、CAAT框、TATA框等功能区;当转染SNanog-pAcGFP1-N1重组质粒后,小鼠胚胎和小鼠胚胎干细胞中能检测到绿色荧光,且在转染72h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中不能观察到GFP。结果表明:本试验成功克隆获得绵羊Nanog启动子,所构建的真核表达载体具有在多能干细胞中特异性表达活性。     

鼠疫菌素的克隆表达与活性分析

为了研究鼠疫菌素的抑菌作用,PCR扩增并克隆鼠疫菌素(pst)基因,构建鼠疫菌素原核重组表达质粒pET28a-pst,在大肠杆菌BL21中表达。经His标签蛋白纯化柱纯化获得重组鼠疫菌素蛋白,并检测表达蛋白的抑菌活性。结果表明,鼠疫菌素基因长1 074 bp,重组鼠疫菌素为44 kD,以包涵体形式表达。纯化的鼠疫菌素对金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌078具有一定的抑菌作用。研究结果将为进一步研究鼠疫菌素的应用奠定基础。     

猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析

为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析.结果显示,猫IFN-α有21个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化位点和...     

猫ω干扰素基因的克隆表达及其活性测定

根据已知人、马、牛、羊、兔、鹿等物种体内IFNω的基因序列分析,设计引物进行扩增。将扩增基因克隆于原核表达载体pET-His。将重组表达载体转入宿主菌进行诱导表达,表达产物以包涵体的形式存在,大小约为20kDa,表达量达到28%。将表达产物复性纯化处理后加入猫肾上皮细胞（CRFK）,用水泡性口炎病毒（VSV）攻毒,测出重组IFNω的生物活性达到1.64×106U/mg,重组蛋白质的含量约为18mg/L。     

牦牛干扰素tau基因的克隆表达及其活性测定

作为Ⅰ型干扰素,IFN-tau具有很高的抗病毒和抗增殖活性和免疫调节等功能,近年来研究还发现IFN-tau具有较高的抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)复制的活性[1].与其他干扰素不同的是IFN-tau仅在反刍动物妊娠发育初期的胚胎滋养层细胞中表达,无需病毒诱导,有延长黄体发挥功能的时间的作用.     

金黄色葡萄球菌FnBA活性基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(FnBA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了1 735 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-FnBA.以HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切pMD18-T-FnBA和pET28a(+),将纯化的基因FnBA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-FnBA,并将其转化至E.coli BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约85 000处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带.又经Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性.     

鸭β-防御素4cDNA的克隆、表达及其抑菌活性的初步分析

本研究旨在克隆与表达鸭β防御素4(AvBD4)基因及测定其生物学特性,并检测其在鸭脏器组织中的分布.采用RT-PCR方法从鸭法氏囊组织中扩增到鸭AvBD4,其cDNA大小为171 bp,编码56个氨基酸.经同源性分析,鸭AvBD4与鸡AvBD4的氨基酸序列同源性最高,达73.2％.将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD4.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃进行诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,重组鸭AvBD4蛋白的相对分子质量约为32 ku,与预期大小一致.该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性,结果显示,重组鸭AvBD4蛋白具有广谱的抗菌活性,对11种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌作用.在高盐离子条件下,重组鸭AvBD4蛋白仍具有抑制金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌的作用.此外,该重组蛋白的溶血活性极低.运用实时荧光定量PCR法检测到该基因在鸭组织器官中表达局限,仅在盲肠扁桃体、脾脏和法氏囊中表达.     

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK的表达及其多克隆抗体的制备

将噬菌体与细菌孵育25min提取噬菌体感染细菌的总RNA,通过逆转录的方法获得cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到目的片段,以pET-15b为载体构建重组质粒pET-15b—lysK并转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达金黄色葡萄球菌噬菌体K裂解酶基因lysK,表达产物蛋白经镍柱纯化后,测定LysK的裂解活性、裂解谱,并免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明,成功诱导表达可溶性LysK并获得重组蛋白,酶谱试验证明LysK对金黄色葡萄球菌具有裂解活性,LysK比噬菌体K裂解谱广。制备的兔多克隆抗体能够与LysK发生特异性反应且具有较高效价,为后续进行LysK体内治疗研究打下了基础。     

猪源IFN-λ3的克隆、表达及抗病毒活性分析

为了解猪源IFN-λ3的体外抗病毒活性,本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞(CRL2845)中扩增获得猪源IFN-λ3基因(pIFN-λ3),并将pIFN-λ3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pCDNA3.1-pIFN-λ3,利用脂质体转染293细胞。48 h后通过Western blot分析p IFN-λ3瞬时表达情况,取转染后上清分别作用于PK15、MDCK细胞进行p IFN-λ3抗病毒活性分析。结果显示,本研究成功扩增获得pIFN-λ3基因,并在293细胞内成功表达;瞬时表达能够抑制表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein,VSVG)在PK15、MDCK细胞上的增殖。本研究结果为深入研究猪源IFN-λ3在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用提供参考和依据。