产细菌素乳酸菌的筛选及其发酵牛奶的工艺优化

为获得高产细菌素乳酸菌,应用于动物生产中,以大肠埃希氏菌ATCC25922、鼠伤沙门氏菌CMCC50115、金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌,通过打孔法排除有机酸和过氧化氢的干扰及通过蛋白酶敏感性试验,得到优产细菌素菌株S-1,并以10%脱脂乳为基础培养基进行发酵工艺优化。结果表明:葡萄糖和酵母浸粉的最佳添加量分别为10 g/l和6 g/l,最佳发酵条件为:接种量4%,起始pH值为6,发酵温度36℃,发酵时间48 h。此研究提供一种动保用乳酸菌素产品发酵方案,经济实用。     

健康动物肠道源产窄谱细菌素乳酸菌的筛选鉴定

从健康猪、鸡、兔新鲜粪便及鸡肠道内容物等78份样品中分离乳酸菌,以大肠杆菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌筛选有明显抑菌活性的菌株,同时进行产细菌素的乳酸菌筛选,并测定抑菌谱;进一步通过生化试验,并结合16S rRNA基因测序结果确定菌株的种类,采用溶血试验和动物试验确定分离菌株的安全性。结果表明,在分离得到的30株乳酸菌中,共有8株对指示菌有抑制作用,其中1株为产窄谱细菌素的短乳杆菌。本研究为下一步探讨产细菌素短乳杆菌作为天然防腐剂和抗菌剂提供了材料。     

1株抗猪链球菌细菌素产生菌的筛选与鉴定

本试验从健康未断奶的仔猪粪便中分离出一株对猪链球菌有较好抑制作用的菌株1～6,排除有机酸、过氧化氢、菌体细胞等的干扰后仍有抑菌活性;用蛋白酶K处理后, 其抑菌活性消失;进一步硫酸铵沉淀、透析处理后, 其抑菌活性显著增强, 因此确定该抑菌活性物质为蛋白类物质, 进而确定菌株1～6为细菌素产生菌.通过个体及菌落形态、生理生化试验、16S rRNA基因序列同源性比较, 结果证明1~6菌株为屎肠球菌.     

传统乳制品中-产细菌素乳酸乳球菌的筛选

采用平板挖井扩散法对从内蒙古传统乳制品中分离鉴定的34株乳酸菌的细菌素产生特性进行研究。在排除有机酸和过氧化氢的干扰后发现，一株乳酸乳球菌CB20—2的发酵上清液对革兰氏阳性60乳酸菌和非乳酸菌显示出抑菌活性，但对革兰氏阴性菌无抑菌作用。其蛋白特性及广谱抑菌性表明乳酸乳球菌CB20—2产生的抗菌物质是一种细菌素。     

产细菌素乳酸菌的分离与筛选

本试验从国内多种发酵材料中分离培养出5株乳酸菌(L1、L2、L3、L4、L5),该5株乳酸菌发酵上清液均对大肠杆菌(G-)、枯草芽孢杆菌(G+)有显著抑制作用。在排除有机酸、过氧化氢等因素对抑菌效果的影响后,初步确定5株乳酸菌发酵上清液中的抑菌物质为细菌素,且该细菌素对非蛋白酶类、温度和有机溶剂不敏感。     

营养因素对猪源产细菌素乳酸菌R—21—1的抑菌活性的影响

分别考察了甘油(G)、玉米浆(C)、中草药-1(P.O)和中草药-2(P.CH),以及胡萝卜汁(CO)对猪源产细菌素的乳酸菌R-21-1的抑菌活性的影响,并且得到了G、C、P.O、P.CH四个因素对R-21-1最佳培养基配方为含G 0.5%、C0.1%、P.O 2.5%、P.CH 1.25%的MRS,对R-21-1抑菌活性影响的主次顺序依次为G＞P.O＞P.CH＞C.     

产细菌素乳酸菌LS-1的全基因组测序分析

前期研究从内蒙古手工奶酪中筛选出1株可拮抗金黄色葡萄球菌的乳酸菌Lacticaseibacillus saniviri(LS-1)。为探究LS-1的全基因组信息,挖掘其潜在细菌素编码基因簇,本试验对LS-1进行全基因组测序,对编码基因进行预测,并采用非冗余蛋白质(Nr)和基因本体(GO)数据库进行功能注释;利用BAGEL4数据库预测分析细菌素合成基因簇。结果显示,LS-1的基因组大小为2 356 714 bp, GC含量为47.87%。共预测到2 316个编码基因,其编码基因总长度为2 058 534 bp,平均长度为888 bp。LS-1所分泌细菌素属于Ⅲ类细菌素中的Enterolysin A(EnlA),推测EnlA可能通过裂解细胞壁来实现抑菌作用。本试验通过全基因组测序对LS-1基因组进行全面分析,从基因水平阐明其细菌素编码基因簇,进一步明确了菌株LS-1所产细菌素具有作为新型替抗产品的潜力。     

湖南省猪链球菌病病原的耐药性调查

为了临诊上能够迅速治愈猪链球菌病,本试验对湖南省不同地区分离得到的猪链球菌进行了治疗药物筛选。试验结果表明：阿莫西林、阿米卡星、头孢唑啉和林可胺类对湖南省猪链球菌有较为显著的抑菌效果。     

卤水中耐酸耐盐产细菌素乳酸菌的筛选

为筛选出适合作为微生物饲料添加剂且有抑菌活性的乳酸菌,以贵州省黔东南苗族侗族自治州农家生产卤水为试验对象,筛选耐酸、耐盐且有抑菌活性的乳酸菌。采用琼脂扩散法,对其生长曲线、产酸能力、耐酸能力和耐盐能力进行研究,经过观察其生长特性、生理生化鉴定、16S r DNA测序分析对菌种进行鉴定,并通过排酸试验、排过氧化氢试验和蛋白酶敏感试验对其抑菌物质种类进行初步分析。结果显示：从卤水中初步分离出的155株菌,筛选得到1株MMB-09,对金黄色葡萄球菌、腐败希瓦氏菌、大肠杆菌以及蜡样芽孢杆菌有良好的抑菌效果,其中对腐败希瓦氏菌的抑菌效果最显著,抑菌圈直径达（14.3±0.42）mm;该菌株在8 h时OD600达到2.0以上,在12 h进入生长稳定期;有较好的产酸能力,8 h时其pH就已经降至4.2;具有较好的耐酸性和耐盐性,在pH为3和盐含量80 g/L时仍生长良好。对菌株进行形态学特征、生理生化鉴定和16S r DNA测序分析鉴定其为植物乳杆菌。该菌株在pH为6时还保留50.15%的抑菌活性,对过氧化氢酶不敏感以及蛋白酶处理后抑菌效果下降明显（P <0.05）,表明其抑菌成分中包含蛋白类...     

枯草芽孢杆菌细菌素研究进展

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是“Generally regarded as safe”(GRAS)级别益生菌种,在医药、食品、农业、畜牧业、水环境改善等方面用途很广。文章介绍了B. subtilis由核糖体合成的多肽（Bacteriocins,细菌素）的研究进展,包括其分类、结构特征、作用机理和抑菌谱,对基因组组成和Bacteriocins基因簇结构特征进行了简介,并对B. subtilis及其Bacteriocins的进一步开发利用进行了展望,为相关科研工作者提供参考依据。     

猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶序列分析及其PCR检测

对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为1231bp,与Genbank发表的该基因序列相比,核苷酸同源性高于99%,推导的氨基酸同源性高于96%。根据精氨酸脱亚氨酸酶基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法,35株猪链球菌致病株中,30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;14株正常猪扁桃体分离株中,11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各一株,均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因的片段。     

猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆和序列分析

对猪链球菌2型、7型、9型的标准菌株和7株猪链球菌2型分离菌的谷氨酸脱氢酶(GDH)基因进行PCR扩增,经回收纯化后克隆到PMD18-T载体,筛选阳性克隆菌后测序并对其进行序列分析。结果,PCR扩增出1300bp左右的片段,包括GDH基因的整个开放阅读框,而测序结果表明,其序列与GenBank中的猪链球菌GDH基因序列一致,进一步序列分析表明,GDH的核苷酸序列在相同血清型之间同源性高达99%以上,而在不同血清型之间的同源型也达到了96%以上,而其氨基酸序列同源性则都在99%以上,且都具有GDH1型家族的功能区域。说明猪链球菌GDH基因及其蛋白具有高度的保守性,为进一步研究与应用提供了重要依据。     

中药水提物对体外猪链球菌生物被膜作用的试验

猪链球菌耐药性与生物被膜的形成有关,本试验选取常用的20味清热解毒的中药,采用微量稀释法测定20味中药水提物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),采用卡尔加里生物被膜装置和平板稀释法测定20味中药在亚MIC(1/2 MIC)药物浓度下对生物被膜的干预作用,结果表明:丁香叶、金银花、黄芩、穿心莲、黄柏和鱼腥草等中药水提物干预生物被膜效果显著(P0.05)大黄、黄连水提物干预生物被膜效果极显著(P0.01),通过细菌计数发现,0~72h,1/2MIC中药提取物对猪链球菌数量影,响不显著(P0.05)。丁香叶、大黄和黄连水提物对生物被膜中的猪链球菌具有很好的杀灭作用(P0.05)。     

猪链球菌RAPD-PCR(RAPD)反应条件的优化

研究猪链球菌随机扩增多态性DNA(RAPD)扩增条件。结果表明,当MgCl2浓度为2mmol/L,DNA模板为50ng,dNTP加入量为1.5μL/25μL时扩增效果最好;引物SBSBG07、SBSBG10、SBSBG17及SBSE03、SBSE05、SBSE11号扩增效果较好,即有6条引物可获得理想的扩增结果。     

猪链球菌的分离鉴定及毒力分析

通过对山西某猪场发病猪组织器官分离的病原菌鉴定以确定病原微生物以及其毒力强弱。主要从发病猪的关节液、肝脏、心脏、脾脏等器官内采集病原菌经过培养、镜检、生化试验初步鉴定后,用PCR方法通过扩增gdh基因和16SrDNA基因,16SrDNA测序后与国内外一些地区分离株的同源性比对,MLST(aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA)分型研究、血清学分型以及mrp,ef,sly 3对毒力基因的扩增分析,结果鉴定为猪链球菌2型(SXZ-1株),16SrDNA序列与国内外部分地区菌株序列的同源性达到99%¹00%。MLST型为ST7型,具有强致病性(mrp+ef+sly+),表明山西存在ST7型强毒2型猪链球菌。     

Virulence-associated gene profiling of Streptococcus suis isolates by PCR

Definition of virulent Streptococcus suis strains is controversial. One successful approach for identification of virulent European strains is differentiation of capsular serotypes (or the corresponding cps types) and subsequent detection of virulence-associated factors, namely the extracellular factor (EF, epf), the muramidase-released protein (MRP, mrp) and the hemolysin suilysin (SLY, sly). In this work we present a novel multiplex PCR (MP-PCR) and an mrp variant PCR for identification and characterization of virulent S. suis strains. These new methods were used to identify association of disease with particular profiles of virulence-associated genes. The MP-PCR allowed identification of S. suis through detection of the housekeeping gene gdh, differentiation of four cps types (1, 2, 7 and 9), and detection of epf, mrp, sly and arcA (arginine deiminase from S. suis). Furthermore, this study describes the first PCR assay for differentiation of at least six mrp variants. Expression of the corresponding size variants of MRP was shown for four of the six mrp variants, but was undetectable for the two larger mrp variants in the particular strains investigated. The results of this study suggest that cps7 strains are associated with pneumonia and that variation of mrp is very pronounced among these strains. Gene profiles of invasive, pneumonia and carrier S. suis isolates by combination of PCR assays allowed differentiation of 24 different genotypes among cps1, 2, 7 and 9 strains. Forty-five percent of the invasive S. suis diseases investigated in this study were caused by only two of these genotypes, namely cps2/mrp+/epf+/sly+ and cps9/mrp(*)/epf-/sly+. Thus, this study demonstrates for the first time a uniform profile of the particular virulence-associated genes for the vast majority of the investigated invasive cps9 strains.     

Presence of the Streptococcus suis suilysin gene and expression of MRP and EF correlates with high virulence in Streptococcus suis type 2 isolates

Nineteen Streptococcus suis type 2 isolates that had been analyzed previously for hemolysin production, ribotype, and virulence in pigs were examined for presence of the gene coding for suilysin by PCR amplification, and southern blot and hybridization techniques. Based on southern blot and hybridization analysis, all isolates tested contained at least a portion of the suilysin gene. PCR amplification of the entire gene resulted in gene fragments from five of the seven highly virulent isolates and none of the moderately virulent or avirulent isolates. Additional PCR analysis showed that mutation or deletions at the 5′ end of the suilysin gene in the less virulent isolates prevented amplification of the sly gene fragment from those isolates. The MRP+ (muramidase-released protein) EF+ (extracellular protein) phenotype was also expressed by the same five highly virulent/sly+ isolates.     

Streptococcus suis serotypes associated with disease in weaned pigs

Streptococcus suis was recovered from 9 outbreaks of septicaemia and meningitis in weaned pigs between 1979 and 1983. Fifteen isolates from 7 outbreaks were identified as S. suis type 9, and 3 isolates from 2 outbreaks as S. suis type 2. Three further isolates of S. suis type 2 and an isolate of S. suis type 3 were recovered from cases of bronchopneumonia in weaned pigs from 4 other piggeries.     

猪链球菌血清9型菌株分离鉴定及强毒株筛选

为了筛选猪链球菌血清9型(SS9)强毒株并研究其生物学特性,对全国各地发病猪的病料中进行猪链球菌分离培养。通过形态学观察、革兰氏染色镜检、PCR鉴定及血清型分型确定了29株猪链球菌血清9型菌株,分别命名为SS9-1～SS9-29。通过玉米大蜡螟幼虫和Balb/c小鼠对29株猪链球菌血清9型菌株进行初筛和复筛,筛选出2株猪链球菌血清9型强毒株,分别为SS9-20、SS9-22。为进一步了解SS9-22的生物学特性,对其进行生长曲线绘制、毒力基因检测及小鼠致病性试验。结果显示,SS9-22菌株在37℃培养6 h时,菌液密度可达到最高值。毒力基因检测发现SS9-22的毒力基因型为gapdh⁺/sly⁺/fbps⁺/orf2⁺/mrp~﹣/89K~﹣/gdh⁺/epf⁺。SS9-22菌株经腹腔接种Balb/c小鼠,24 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、被毛耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD₅₀为3.2×10⁷CF...