大肠杆菌耐药菌的体外诱导及主动外排基因acrA表达量的变化

为探讨大肠杆菌的体外诱导及主动外排基因acrA表达量的变化,首先对选定大肠杆菌进行耐药性培养,得到各大肠杆菌的0,5,10,15,20,25及30代菌,测定MIC的变化,结果表明不同菌株的不同代数的主动外排基因acrA表达量均有变化.随着耐药性增加,大肠杆菌的主动外排基因acrA表达量也有所增加.以上结果表明大肠杆菌的...     

环丙沙星耐药益生素菌株的筛选试验报告

抗菌药与微生态制剂联合应用在理论和实践上具有重要意义,而实现这一重要意义其首要前提是获得耐药菌株。本试验对五个芽孢杆菌菌株、三个乳酸杆菌菌株、六个酵母菌菌株,进行了环丙沙星的药敏试验,从而筛选出耐环丙沙星的菌株。1　材料11　菌株　无毒蜡样芽孢杆菌ＤＭ—423由促菌生中分离获得,枯草芽孢杆菌1108株系由中科院微生物研究所提供。地衣芽孢杆菌三个菌株,酵母菌六个菌株,乳酸杆菌三个菌株,为自己开发。12　药品　环丙沙星药敏纸片系由山东农大动科院提供,环丙沙星原粉由山东农大动科院兽药厂提供。2　方法与结果21　各菌株的药敏…     

AcrAB-TolC主动外排系统与猪源耐药大肠杆菌多重耐药的相关性

以前期获得的25株猪源耐药大肠杆菌为试验菌株,采用药敏纸片法测定以上分离菌株对氟苯尼考、多西环素、庆大霉素等11种药物的敏感性,并分析其多重耐药表型;采用PCR方法和实时荧光定量PCR方法分别检测25株猪源大肠杆菌中AcrAB-TolC主动外排基因的携带率以及不同耐药数量的多重耐药菌株的外排泵基因arA和acrB的表达量,同时分析其主动外排调控基因marA、soxS、robA和acrR相对表达量的差异,从mRNA水平上探讨外排泵基因表达量和调控因子与大肠杆菌多重耐药性的相关性。结果显示,25株耐药大肠杆菌中acrA、acrB和tolC等3种主动外排基因的携带率分别为68.00%、72.00%和76.00%;acrA、acrB这2种主动外排基因以及调控基因marA和soxS的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈正相关,调控基因acrR的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈负相关;robA调控基因的表达量均低于标准菌株,且与耐药谱数无明显相关性。结果表明,猪源耐药大肠杆菌携带acrA、acrB、tolC等3种基因主动外排基因的携带率较高,且与多重耐药菌株的耐药谱具有相关性;调控因子的表达量亦与多重耐药的耐药谱具有相关性。     

猪lipasin基因的克隆及其对肝细胞LPL基因转录的影响

旨在克隆猪lipasin基因,并检测其对肝细胞LPL基因转录的影响。本试验利用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因,构建其真核表达载体转入肝细胞,探讨其对LPL基因转录的影响。结果表明,成功克隆了猪lipasin基因,目的片段大小为615bp,上传至GenBank(登录号:KF017598),开放阅读框为594bp,编码197个氨基酸,liapsin蛋白的分子量和等电点分别为21.99ku和6.79;成功构建了真核表达载体PB-EGFP-lipasin,实现lipasin基因在肝细胞中的过表达,与对照组相比,PB-EGFP-lipasin转染的细胞中LPL基因的转录水平显著下降。结果提示,猪lipasin可能通过抑制肝细胞LPL的转录影响脂代谢。     

单色光对肉鸡视网膜和松果体视蛋白基因转录的影响

为了研究单色光对肉鸡视网膜和松果体黑素视蛋白基因(OPN4-1和OPN4-2)、视网膜绿敏感锥体视蛋白基因(CHK-1)和蓝敏感锥体视蛋白基因(CHK-2)mRNA转录的影响,笔者选用刚出壳的雄性AA肉鸡40羽,分别饲养在白光(400～700 nm)、红光(660 nm)、绿光(540 nm)和监光(480 nm)下2周,单色光源采用冷LED灯,光照度为15 lx.于第14天分别取视网膜和松果体,提取总RNA,RT-PCR反转录后用上述4种肉鸡相关视蛋白基因的引物进行PCR扩增.结果显示:(1)视网膜和松果体蓝光组OPN4-1 mRNA的表达均显著较白光组高13.44%和16.77%(P<0.05),但视网膜中红光组和绿光组均分别显著较白光组低16.62%和10.94%(P<0.05),而松果体中绿光组与白光组差异不显著(P>0.05);(2)视网膜和松果体OPN4-2 mRNA表达均是红光组最高,其次是蓝光组,而绿光组均最低(P<0.05);(3)视网膜中4个光组CHK-1 mRNA表达均大于CHK-2 mR-NA表达(P(0.05),其中绿光组CHK-1 mRNA表达分别显著较红光和蓝光组高24.37%和9.94%(P<0.05),但与白光组差异不显著;蓝光组CHK-2 mRNA表达分别显著较红光和绿光组高40.90%和8.94(P<0.05),但与白光组差异不显著(P>0.05).以上结果表明,不同视蛋白具有不同的光色敏感性.与红光和绿光相比,蓝光促进视网膜和松果体OPN4-1的转录.     

PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞IFITM3基因转录的影响

干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon inducible transmembrane proteins 3,IFITM3)作为抗病毒蛋白可以抑制多种病毒的感染,本研究针对猪IFITM3基因设计特异性引物,构建重组质粒并作为阳性标准品,建立了检测IFITM3基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法最低检出下限为10~2 copies/μL,且线性关系好(R~2≥0.997),敏感性高,特异性强,重复性好,批内、批间变异系数均小于3%。将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)细胞,在不同感染时间对细胞中IFITM3 mRNA进行检测。结果显示,PRRSV感染早期IFITM3转录水平保持不变,在感染后转录水平逐渐升高。IFITM3 mRNA在PRRSV感染PAM过程中转录变化,可能是PRRSV宿主免疫逃逸的机制之一。     

体外诱导禽巴氏杆菌环丙沙星耐药株及耐药机制的初步分析

为了探讨在环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)药物培养后,多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)对CIP的药物敏感性变化及其耐药机制,试验采用体外递增药物浓度的方法诱导出禽源Pm标准株C48-1对CIP的耐药菌株,并对CIP耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)值变化及耐药稳定性、生化特性、生长曲线和基因组位点突变进行了研究。结果表明:诱导的CIP耐药菌株的MIC由0.25μg/mL上升至16μg/mL;与亲本株比较,生化特性与生长曲线无显著差异,但诱导株的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)gyrA基因编码的氨基酸发生了Thr99→Ala的变化,该位点突变首次发现,gyrB、parC、parE耐药基因均未发生变化。说明逐步递增药物浓度可以诱导禽源Pm对氟喹诺酮类药物的耐药性,并导致靶基因发生突变。     

重组鸡GSTA3蛋白对福美双诱导胫骨软骨发育不良肉鸡红细胞免疫相关基因转录的影响

为研究胫骨软骨发育不良(TD)肉鸡红细胞免疫相关基因转录水平的变化及重组鸡谷胱甘肽S-转移酶A3(chGSTA3)蛋白对TD肉鸡红细胞免疫相关基因转录的影响,将120只肉雏鸡饲喂一周后,随机分为基础日粮组(A、B、C组)和福美双处理组(D、E、F组),对福美双处理组肉鸡通过饲料中添加100mg·kg~(-1)福美双诱发建立肉鸡TD模型,通过腿部肌肉注射法,对B组和E组肉雏鸡注射有活性的低剂量(20μg·kg~(-1))重组GSTA3蛋白,对C组和F组肉雏鸡注射高剂量(50μg·kg~(-1))重组GSTA3蛋白,对A和D组的肉雏鸡注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS);使用Real-time PCR对肉鸡红细胞中免疫基因的信使RNA(mRNA)转录水平进行检测。结果显示,Toll样受体(TLR)2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、髓样分化因子88(MyD88)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ、核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族中的C5型受体(NLRC5)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白细胞介素-7(IL-7)基因可以在鸡红细胞转录;福美双处理组D与磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理组A相对比,TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、MyD88、TRAF6、MHCⅡ和NLRC5在试验的第4天显著升高,IL-7显著降低(P0.05),在试验的第15天TD肉鸡红细胞中TLR2、TLR4、MyD88和NLRC5显著下调(P0.05),IL-7、TLR3、TLR5、TLR7、TLR15、MHCⅡ、TRAF6变化不明显(P0.05);E组和F组与D组相比,在试验第4天,除E组TLR4、TLR5和MyD88外,其余基因都有显著性变化(P0.05);在第15天,E组中TLR4、TLR5、MyD88和NLRC5,及F组中TLR3、TLR5、MyD88、TRAF6和IL-7变化不显著,其他基因都有显著性差异(P0.05)。鸡红细胞可能通过免疫相关基因TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、IL-7、MyD88、TRAF6、MHCⅡ和NLRC5转录水平的变化,在早期诱导TD发生,后期减轻肉鸡TD症状;GSTA3能够对福美双诱导肉鸡TD的作用产生影响。     

DHPLC对环丙沙星诱导沙门菌靶基因和调控基因的突变筛选

选择11株动物源沙门菌(包括6种血清型)进行环丙沙星耐药性体外诱导.应用变性高效液相色谱(DH-PLC)对11株诱导株不同诱导阶段的靶基因gyrA、gyrB、parC、parE的喹诺酮耐药决定区(QRDR)和mar操纵子基因marO、marR、marA、marB、soxR、soxS及外排泵acrAB的抑制基因acrR(包括启动子区)进行基因突变筛选,并对筛选出的突变基因进行测序确证.结果显示,6种血清型沙门菌在诱导过程中,GyrA突变集中在S83F和/或D87G,marR、soxR、acrR均出现新突变,提示在环丙沙星诱导压力下,因靶基因和调控基因突变使耐药性不断增加.     

细菌内毒素对鸡NLRC5信号通路相关基因转录的影响

通过LPS刺激鸡成纤维细胞系(DF-1),分别在0、2、4、6、8、12、18和24h等8个时间点采集细胞,提取总RNA,并设计相关引物,应用荧光定量PCR方法检测NLRC5信号通路相关基因(NLRC5、NF-κB、MHC-I、IL-6、IL-18、STAT1、STAT3和TLR4)mRNA表达变化规律。结果显示,LPS刺激后,NF-κB、MHC-I、IL-6、IL-18和STAT3的转录水平均呈现先显著下降(P0.05)后上升的趋势,NLRC5和TLR4先显著上升后下降的趋势(P0.05),STAT1的mRNA转录水平无显著性变化(P0.05)。研究表明LPS刺激能够引起鸡DF-1细胞产生免疫反应,鸡NLRC5对NF-κB的转录起负调控作用。     

喹诺酮类耐药决定区、外排泵负调控基因对大肠杆菌氟喹诺酮高水平耐药分子机制的影响

为了探讨耐喹诺酮类决定区(QRDR)、外排泵负调控基因(acrR、marR和soxR)突变对临床分离株氟喹诺酮(FQs)高水平耐药的影响,本研究对临床分离的18株FQs耐药大肠杆菌(E.coli),采用PCR方法检测QRDR、acrR、marR和soxR的突变情况;通过RT-PCR的方法检测外排泵及膜孔蛋白相关基因的表达水平。结果显示,QRDR的突变主要集中在常规突变GyrA(Ser83Leu 和 Asp87Asn)和ParC(Ser80Ile),同时也检测出稀有突变ParC Glu84Gly、Glu84Lys、Glu84Val和Glu84Ala,ParE Ser458Ala等。ED28在acrR基因存在777 bp插入序列;12株菌(包括ATCC25922)在MarR存在Gly103Ser和Tyr137His双突变,其中EP26和EG42存在插入片段;ED40在SoxR存在Thr38Ser、Gly74Arg氨基酸替换。在多突变药菌株中,AcrAB的表达水平明显升高,OmpC和OmpF表达量降低、甚至缺失。     

猪链球菌2型多重耐药菌株的人工诱导

采用6种常用抗菌药物对临床分离的38株猪链球菌2型进行敏感性检测,从中选择3株对红霉素和环丙沙星敏感的菌株,采用体外递增药物浓度的方法分别诱导成对红霉素和环丙沙星耐药的菌株,按临床检验标准委员会(CLSI)推荐的方法测定了红霉素和环丙沙星对同一亲本的敏感株和诱导耐药株的体外最小抑菌浓度(MIC),并测定在外排泵抑制剂利血平存在的情况下敏感株和诱导耐药株的MIC变化情况。微量稀释法测定的MIC结果显示:在所选的6种抗生素中,氟苯尼考和氨苄西林对临床分离的38株猪链球菌的作用最好,抑菌率都为100%,红霉素及环丙沙星有一定作用,耐药率分别达39.5%(15/38)和28.9%(11/38),而磺胺间甲氧嘧啶、四环素的抑菌效果最差,耐药率达100%。浓度递增法成功诱导了猪链球菌2型菌株对红霉素和环丙沙星耐药性,其MIC值分别由0.001 8 mg/L上升至128 mg/L。在外排泵抑制剂利血平存在的情况下,抗菌药物对部分猪链球菌2型菌株的MIC值下降。结果提示:逐步增加药物浓度可以诱导猪链球菌2型菌株对红霉素和环丙沙星的耐药性,而且猪链球菌2型菌株耐药性的产生可能与耐药性相关的主动外排机制有关。     

大肠杆菌主动外排系统的研究进展

由于各种抗生素在临床上的广泛应用,导致细菌多重耐药菌株(Multiple-resistant strain,MRS)的不断出现.由主动外排系统介导,阻止药物在菌体内积聚是细菌产生多重耐药性的主要机制之一,主动外排系统在细菌多重耐药性的研究中显得越来越重要.目前大肠杆菌主动外排系统的研究已成为热点,现已发现大肠杆菌中存在多种主动外排系统,如AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE等.本文就近年来有关大肠杆菌主动外排系统的研究作以介绍.     

细菌内毒素对鸡NLRC5受体及IFN基因转录的影响

本研究旨在探讨鸡NLRC5受体及IFN基因对不同细菌内毒素的诱导表达变化,为禽类NLRC5受体的分子功能及其参与先天免疫调控的作用机制提供理论依据.用不同浓度的(0、0.1、1.0、10.0 μg·mL-1)来自致病性大肠杆菌(E.coli,EC)和肠炎沙门氏菌(S.enteriditis,SE)的2种内毒素(LPS)分别刺激鸡天然巨噬细胞系(HD11)2、4和6h,在不同的时间点收集细胞,提取总RNA,并设计相关引物,利用荧光定量PCR分析鸡NLRC5受体以及下游功能基因IFNA和IFNB的转录量变化,探讨HD11细胞对不同来源的细菌内毒素的免疫反应.研究表明:与对照组相比,1.0和10.0μg·mL-1的EC-LPS、SE-LPS均能诱导HD11细胞产生免疫应答,但0.1μg·mL-1组未能诱导成功;不同细菌LPS诱导的免疫应答时间不一致,经EC-LPS诱导的NLRC5和IFNB基因均在刺激后6h达到转录高峰,与2、4h差异显著(P＜0.05),与对照组差异极显著(P＜0.01);但IFNA基因在2、6h达到高峰,而在4h下降,呈“V”型转录趋势.SE-LPS诱导的NLRC5和IFNA、IFNB转录量随时间均保持一直上升的趋势,在6h达到高峰,且与对照组及2、4h差异显著(P＜0.05).结果表明NLRC5受体与IFNA和IFNs共同参与了细胞对细菌内毒素的免疫应答,NLRC5基因可能对鸡先天免疫功能具有调节作用.     

REV感染对鸡NLRC5及其信号通路相关基因转录的影响

为探讨鸡NLRC5信号通路相关基因在禽网状内皮组织增生病病毒(REV)刺激后转录水平的变化,通过REV刺激鸡胚成纤维细胞(CEF),在刺激后7天采集细胞,提取总RNA,并设计相关引物,应用荧光定量PCR方法检测NLRC5信号通路相关基因(NLRC5、MHC-I、IL-6、IL-18、STAT1、STAT3、NF-κB)m RNA表达变化规律。结果表明:REV感染后MHC-I、IL-18、STAT1和STAT3的转录水平高于未刺激组,差异显著(P0.05),NLRC5、IL-6和NF-κB转录水平低于未刺激组,差异不显著(P0.05),研究初步证实REV刺激能够引起CEF产生免疫应答反应,且对NLRC5基因及其信号通路产生影响,REV可能通过抑制NLRC5基因表达来抑制机体先天性免疫。     

四环素外排泵耐药基因tet40和tet42的研究进展

四环素类药物是发现于上个世纪40年代的一类广谱抗生素,从50年代开始应用于医学临床[1].由于其具有抗菌谱广和毒性低等特点,因而在兽医临床上得到广泛应用,成为用于防治细菌性感染的常见药物.随着药物使用年限的增加,四环素类药物的耐药水平和耐药率也随之增强.有研究显示,分离自猪、牛、人的大肠杆菌O157对四环素的耐药率极高(97%,100%,100%)[2],在184株沙门菌分离株中,四环素的耐药率达到了66%[3].     

传染性法氏囊病病毒感染对鸡细胞模式识别受体及抗病毒基因转录的影响

为研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡细胞模式识别受体(PRRs)及天然免疫抗病毒基因转录的影响,本实验分别采用IBDV弱毒感染DT40细胞和强毒感染SPF鸡,以荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)检测感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的m RNA转录变化。在IBDV感染DT40细胞的2 h到24 h内,ch MDA5、ch TLR3、ch LGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx的转录水平显著上升,分别为324、22、61、29、16、225 000和18 700倍。当采用si RNA分别敲除DT40细胞中ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2时,IPS-1、IRF3、PKR、OAS和Mx在IBDV感染后的2 h到24 h差异变化不显著。在IBDV感染SPF鸡法氏囊组织细胞中,ch MDA5和ch TLR3的表达显著降低,而ch LGP2表达无显著差异,IRF3、PKR、OAS和Mx的转录水平显著上升。TLR4和TLR7在IBDV的体外和体内感染试验中均未检测到,而IPS-1在IBDV的体外和体内感染试验中均变化不显著。本实验结果表明,ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2在识别IBDV的感染中起着关键作用,IBDV感染严重抑制了PRRS ch MDA5和ch TLR3的转录,并且提示其抑制作用在体内与体外可能存在不同的分子机制。     

禽致病性大肠杆菌ST95流行菌株耐药表型及耐药基因分析

为探究禽致病性大肠杆菌(APEC)ST95类群菌株的耐药表型和耐药基因分布情况,对37株ST95 APEC菌株进行血清型、耐药性测定以及耐药基因检测。结果显示:37株ST95 APEC的优势血清型为O2:K1和O1:K1,所有禽源ST95菌株均为多重耐药(MDR)特性,其至少对12种抗生素耐药,ST95菌株对头孢类抗生素的耐药比率很高,对β-内酰胺酶抑制剂耐药率也达到35%,对非头孢类抗生素如环丙沙星、庆大霉素等同样具有广泛耐药性。PCR检测发现30株APEC菌株含有β-内酰胺酶基因,在这些ST95菌株中检测出多种质粒编码的抗性基因,如链霉素/壮观霉素抗性基因strA和strB等。研究表明ST95 APEC菌株呈现明显的广谱耐药特性,质粒携带的耐药基因广泛分布于ST95菌株。     

家蚕核型多角体病毒orf61基因缺失对病毒复制和各时期基因转录的影响

orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。     

禽呼肠孤病毒感染对SPF鸡外周血淋巴细胞中天然免疫相关基因转录的影响

为了明确禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)感染对宿主天然免疫应答的影响,利用实时荧光定量PCR方法检测ARV感染SPF鸡后外周血淋巴细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、IPS-1、IRF-3、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFITM3、Mx1和OASL等基因在感染后0、12h以及1、2、3、5和7d的转录水平变化。结果表明,ARV感染SPF鸡后7d以内,外周血淋巴细胞中TLR3和TLR21的mRNA转录水平显著降低(P0.05或P0.01);而TLR7和MDA5的mRNA转录水平则在整个试验过程中显著升高,分别在7dpi和1dpi达到峰值(P0.05或P0.01)。IPS-1的mRNA转录被抑制;IRF-3则呈显著转录上调趋势;IFN-α、IFN-β和IFN-γ均表达上调,分别在2~3dpi达到峰值(P0.05或P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的mRNA转录水平也显著升高,均在3dpi达到峰值(P0.01)。试验结果表明ARV在感染早期能够显著性引起TLR7、MDA5、IRF3、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFITM3、Mx1和OASL的转录上调,抑制TLR3、TLR21和IPS-1的转录,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机制奠定了基础。