猪丹毒丝菌CbpB蛋白对小鼠的免疫效果分析

探究猪丹毒丝菌（ER）CbpB蛋白的免疫原性和保护作用,为深入研制ER基因工程亚单位疫苗提供新的思路和技术储备。以表达的ER重组蛋白CbpB、SpaA、CbpB+SpaA以及ER灭活全菌体（V-AEr21）、商品化弱毒疫苗、商品化灭活疫苗分别免疫小鼠。利用间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体,血清杀菌试验测定功能性抗体水平,攻毒试验测定免疫保护率,组织荷菌数试验测定ER定植情况,并采集小鼠组织脏器（脾、肺、肝、肾）制备切片,观察病理变化。结果显示：与免疫原性最优的商品化弱毒疫苗相比,CbpB和SpaA虽产生的IgG抗体均仅为1∶6 400,但血清杀菌效果强;对小鼠的免疫攻毒保护率与商品化弱毒疫苗相同,均为100%,且在脾、肺、肝、肾组织中均无细菌定植,病理组织学观察与空白对照无明显区别。CbpB重组蛋白具有良好的免疫原性和保护作用,能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,可以作为猪丹毒基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

丹毒丝菌spaA基因免疫保护区的克隆与功能研究

本研究以丹毒丝菌XJ1249基因组DNA为模板,根据GenBank已发表的丹毒丝菌表面保护性抗原A (SpaA)的序列设计引物进行PCR扩增,得到大小约1 029 bp的spaA基因N端免疫保护片段(spaA-N)。将spaA-N连接到载体pGEX-4T-1上构建重组原核表达质粒pGEX-spaA-N,对重组质粒进行序列验证后,在IPTG的诱导下,表达和纯化重组蛋白r-SpaA-N,并研究其对小鼠的免疫保护作用。结果显示:分离纯化的重组蛋白具有免疫原性,并对小鼠具有免疫保护性,能够有效防止丹毒丝菌对小鼠的侵染。研究结果为进一步研究丹毒丝菌致病机理,开发新的猪丹毒诊断试剂盒和亚单位疫苗奠定了基础。     

布鲁氏菌DnaJ蛋白的表达及功能分析

本试验旨在运用分子生物学与生物信息学方法对布鲁氏菌DnaJ蛋白进行分析;将该蛋白进行原核表达,并检验纯化蛋白在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应的能力。以布鲁氏菌M5-90为模板成功扩增目的基因DnaJ,构建重组表达载体pET-30a-DnaJ;利用SDS-PAGE检测DnaJ重组蛋白在大肠杆菌中的表达,并对其进行纯化;用DnaJ蛋白刺激RAW 264.7细胞和小鼠脾细胞,并用DnaJ蛋白免疫小鼠;利用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4及小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平的变化。结果显示,DnaJ蛋白二级结构以无规则卷曲结构为主,该蛋白有11个抗原决定簇;SDS-PAGE结果显示,重组菌在37.7 kDa大小的位置有特异表达条带,获得了DnaJ纯化蛋白;DnaJ蛋白可诱导宿主细胞和小鼠产生高水平IFN-γ、IL-4、IgG1和IgG2a抗体。鉴于DnaJ蛋白可在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应,有望成为布鲁氏菌病的候选亚单位疫苗。     

迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ原核表达及免疫原性

为研究迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌flgJ基因,构建重组载体pET-32a-flgJ,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白大小约54 000;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌分离株ET-13进行攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为70%。本研究克隆了迟缓爱德华菌外膜蛋白flgJ基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组FlgJ蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。     

迟缓爱德华菌分子伴侣蛋白GroEL原核表达及免疫特性

GroEL是细菌内分子伴侣蛋白,参与细菌多种生命活动,在布鲁菌、链球菌研究中,GroEL蛋白展示了良好的疫苗潜力。前期利用迟缓爱德华菌抗体Pull-down技术筛选到GroEL蛋白,揭示了该蛋白的潜在应用价值,本试验以迟缓爱德华菌GroEL蛋白作为研究对象,利用大肠杆菌表达系统表达纯化GroEL重组蛋白(rGroEL),进一步通过动物模型评估rGroEL的免疫效果。结果显示,rGroEL能够激发小鼠产生高水平的特异性抗体,具有较好的免疫原性,免疫小鼠对迟缓爱德华菌感染具有较好的抵抗力,相对保护率达95%。斑马鱼感染试验结果表明,rGroEL免疫对迟缓爱德华菌感染具有一定保护效果,保护率为60%。用rGroEL免疫斑马鱼可以产生针对嗜水气单胞菌的免疫保护力,保护率可达45%。本试验初步探索了迟缓爱德华菌重组蛋白rGroEL的免疫特性,为研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗提供了依据。     

锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆表达与免疫原性分析

为了克隆表达锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶(Ace-GST)基因,制备多克隆抗体并分析其免疫原性,为疫苗候选分子的筛选奠定基础。根据GenBank上锡兰钩虫GST基因序列设计引物,利用RT-PCR法扩增Ace-GST基因,将扩增产物克隆至pET-32a载体并转入E.coli BL21(DE3)宿主菌表达,重组蛋白纯化后免疫昆明小鼠,分别用间接ELISA法和MTT法检测免疫鼠血清IgG抗体水平与脾淋巴细胞增殖情况。结果显示Ace-GST基因ORF全长468 bp,编码155个氨基酸,与ν类GSTs聚为同一分支;重组Ace-GST相对分子质量为36 000,可诱导产生特异性IgG抗体,并能显著刺激免疫小鼠脾淋巴细胞增殖。结果表明重组Ace-GST蛋白能诱导昆明小鼠产生特异性免疫应答,具有良好的免疫原性。     

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌强菌株rpoE蛋白的原核表达及其免疫保护效力研究

为研究牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(PM)强菌株rpoE蛋白的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增牛荚膜A型PM的rpoE基因,构建pET-28a-rpoE重组表达质粒,经诱导表达后SDS-PAGE检测结果显示,表达的rpoE蛋白相对分子量约为20 ku,与理论值一致;western blot结果显示该蛋白具有很好的特异性和反应原性;纯化的rpoE蛋白经皮下免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测融合蛋白的免疫原性,结果显示rpoE蛋白可以诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体;PM攻毒后,免疫组保护率为70%。本研究获得的牛荚膜A型PM重组rpoE蛋白具有良好的免疫原性,免疫小鼠后能够提供一定的保护,可以作为研发PM亚单位疫苗的候选抗原。     

迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA原核表达及其免疫原性研究

为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌ompA基因,构建重组载体pET-32a-ompA,将其转化大肠杆菌BL21后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约58 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为55%。本研究克隆了迟缓爱德华菌ompA基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组OmpA蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。     

沙门菌优势抗原NmpC蛋白的免疫特性

NmpC是沙门菌编码的外膜蛋白,也是沙门菌诱导体液免疫的主要抗原。为研究沙门菌NmpC蛋白的免疫特性,本试验对沙门菌nmpC基因进行扩增,并将其克隆到pET-28a载体上,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白rNmpC,进一步将rNmpC免疫小鼠,检测特异性抗体水平;用肠炎沙门菌C50336菌株感染rNmpC免疫小鼠评测其免疫保护效果。结果显示,成功表达和纯化出肠炎沙门菌NmpC重组蛋白,rNmpC大小为38 000;将rNmpC蛋白免疫小鼠,可以刺激小鼠产生高水平特异性抗体;细菌感染试验表明,rNmpC蛋白免疫小鼠可使其产生针对肠炎沙门菌感染的保护力,保护率为70%。本试验证实沙门菌NmpC蛋白的免疫潜力,为进一步研制沙门菌新型疫苗提供了参考。     

迟缓爱德华菌菌毛蛋白原核表达及多抗血清制备

为研究迟缓爱德华菌菌毛蛋白PILI的功能和免疫原性,本研究利用PCR方法从迟缓爱德华菌基因组中克隆出pili基因,并将其构建到pET-32a原核表达载体上,重组载体转化BL21大肠杆菌诱导重组蛋白表达,通过SDSPAGE和Western blot方法验证重组蛋白表达。用亲和层析方法纯化蛋白,纯化的蛋白免疫小鼠,所得的多抗血清能够特异性识别迟缓爱德华菌PILI蛋白,为研究PILI蛋白奠定基础。     

鸭圆环病毒Ⅰ型与Ⅱ型Cap蛋白原核表达及免疫原性分析

为了比较鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)Ⅰ型与Ⅱ型Cap蛋白免疫原性,试验分别选取DuCV-BJ株(HM162350.1,DuCVⅠ型)和DuCV-FJ株(EF370476.1,DuCVⅡ型)Cap基因作为参考序列,进行抗原表位预测,密码子优化与合成,克隆至pET-28a载体,将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中进行诱导表达,获得重组蛋白。重组蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠,检测免疫小鼠体内特异性抗体IgG水平和细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、IL-4。结果表明：DuCV-BJ株和DuCV-FJ株Cap蛋白平均抗原指数分别为1.727和0.505,抗原表位区域存在差异。密码子优化后,密码子适应指数(CAI)由原来的0.89增长至1.00。重组质粒pET28a-BJ和pET28a-FJ均在大肠杆菌中成功表达;重组蛋白rCap-BJ和rCap-FJ免疫Balb/c小鼠后,均可诱导小鼠产生特异性抗体IgG,三免后rCap-FJ组、rCap-BJ组IgG水平极显著高于对照组(P<0.01),但rCap-FJ组与rCap-BJ组差异...     

马流产沙门菌鞭毛蛋白FliC对马腺疫链球菌SeM蛋白免疫效应分析

为研究马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)鞭毛蛋白FliC对马腺疫链球菌(Streptococcus equi subsp.equi)SeM蛋白免疫效果的增强效应,为马腺疫新型高效疫苗的研发奠定基础。本研究构建并诱导表达了FliC,经亲和层析纯化目的蛋白,Western blot检测其免疫原性。将该纯化后FliC与SeM蛋白联合免疫C57BL/6小鼠,免疫后对小鼠进行抗体水平、抗体类型和攻毒保护力的检测。结果表明,成功表达、纯化了FliC重组蛋白,SDSPAGE电泳检测显示该蛋白质为52ku。抗体分型检测结果显示产生的抗体主要以IgG1为主;免疫30d后FliC+SeM免疫组的攻毒保护率为87%,高于SeM免疫组的保护率67%。马流产沙门菌来源的鞭毛蛋白FliC能够增强SeM蛋白的免疫保护效果,该结果为进一步更好地利用SeM蛋白奠定了基础。     

猪丹毒杆菌SpaA优势表位的串联表达及其免疫效果分析

目的 构建串联SpaA优势表位的丹毒亚单位疫苗,并对其免疫原性进行研究。方法 将丹毒杆菌表面保护抗原A优势表位串联表达,提取并经亲和层析纯化获得重组蛋白,制备亚单位疫苗,免疫小鼠和猪,21日后攻毒。结果 成功制备串联SpaA优势表位的丹毒亚单位疫苗,2μg重组蛋白可为小鼠抵抗1000MLD强毒攻击提供100%保护,100μg重组蛋白可为猪抵抗1MLD强毒攻击提供100%保护,可为猪抵抗2MLD强毒攻击提供67%保护。结论 串联SpaA优势表位的丹毒亚单位疫苗具有良好的免疫原性,高于商品化疫苗保护标准。     

迟缓爱德华菌外膜蛋白FadL原核表达及免疫原性

FadL是革兰阴性细菌编码的外膜通道蛋白,参与长链脂肪酸的转运,沙门菌中该蛋白作为免疫原使用具有优良的保护效果。本试验以迟缓爱德华菌FadL蛋白作为研究对象,原核表达并纯化该蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白的免疫特性和免疫效果。结果显示,成功表达和纯化重组FadL蛋白(rFadL),蛋白大小为50 000。小鼠试验结果表明,rFadL免疫小鼠能产生高水平特异性抗体;斑马鱼感染试验结果表明,rFadL能够对斑马鱼迟缓爱德华菌产生一定免疫保护力,保护率可达55%。本试验揭示了迟缓爱德华菌FadL蛋白的免疫特性,为迟缓爱德华菌疫苗研发提供了参考和借鉴。     

迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC原核表达及免疫保护作用

为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的免疫原性,用PCR方法扩增迟缓爱德华菌pagC基因,构建重组载体pET-32a-pagC,将其转化大肠埃希菌BL21后进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白大小约40 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果该重组蛋白对免疫组小鼠具有95%的保护率。研究结果为重组PagC蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

重组大肠杆菌外膜蛋白OmpT对小鼠免疫保护作用的研究

为评价大肠杆菌(E.coli)外膜蛋白酶T(OmpT)的免疫原性及对小鼠的免疫效率,本研究将原核重组表达纯化的OmpT蛋白(rOmpT)免疫小鼠,并以灭活的E.coli 308-2全菌疫苗株作为对照组,通过检测其抗体效价、体外调理吞噬作用和细胞因子表达水平以及攻毒试验进行保护效率评价。结果表明rOmpT免疫组在二免后14 d其抗体水平可以达到峰值(1∶64 000),并且其抗血清具有显著促进巨噬细胞对E.coli的吞噬作用;同时,重组蛋白与全菌免疫组均能够显著提高小鼠体内IL-4和IFN-γ的表达。而且重组蛋白免疫组对4个进化种系(Phylogenetic group)的E.coli攻毒的免疫保护率均为60%左右,比全菌免疫组高约10%。研究结果显示rOmpT比全菌灭活E.coli能够诱导小鼠产生更有效免疫保护作用,表明rOmpT可以作为E.coli亚单位疫苗候选蛋白。     

牛源犬新孢子虫NcGRA9基因原核表达及免疫原性分析

为了确定牛源犬新孢子虫NcGRA9基因的功能及表达蛋白的免疫原性，本试验PCR扩增牛源犬新孢子虫NcGRA9基因，构建克隆质粒pMD18-T-NcGRA9和原核表达质粒pGEX-4T-NcGRA9,转化大肠杆菌BL21感受态细胞中IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达重组蛋白的反应原性，应用重组蛋白与弗氏佐剂混合接种BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平。结果显示，经PCR扩增获得522 bp的NcGRA9片段，表达蛋白纯化后相对分子质量约为45 kDa,具有良好的反应原性；重组蛋白接种BALB/c小鼠后，免疫组小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平均极显著高于PBS对照组(P<0.01),说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验表达的NcGRA9重组蛋白具有良好的抗原性，为新孢子虫病的防控奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白的表达及其免疫原性分析

运用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CPEP)基因,克隆至pMD-19T载体。经鉴定测序验证后,将获得的CPEP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建原核表达质粒pET-32a-CPEP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE以及Western blot分析免疫原性,纯化CPEP,并用纯化的蛋白免疫小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平及攻毒保护率。结果显示,成功构建原核表达质粒pET-32aCPEP;SDS-PAGE分析结果显示,得到约35ku的蛋白;Western blot分析显示,CPEP能与Hps SC-1阳性血清发生抗原抗体的特异性反应,证实该重组CPEP蛋白具有反应原性。以致死剂量的强毒株SC-1攻毒CPEP免疫小鼠,重组蛋白的免疫能够减缓发病,并表现出40%的保护率。重组蛋白CPEP的部分保护作用表明其可以作为免疫候选因子,为未来副猪嗜血杆菌标准化疫苗的研制奠定基础。     

SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)B细胞表位预测、原核表达及免疫学特性

运用ANTHEPROT 5.0综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测MRP的B细胞优势袁位簇;PCR扩增出表达预测的抗原肽段的基因(mrp-1),构建重组原核表达载体pET32a-mrp-1,IPTG诱导表达,以渗透性休克法纯化重组蛋白;使用重组蛋白免疫血清和灭活猪链球菌2型SS2免疫血清Western blotting检测重组蛋白的免疫原性及其与SS2免疫血清的反应性;纯化的重组蛋白免疫雌性SPF昆明小鼠,SS2攻毒受试动物评估重组蛋白对小鼠的免疫保护力.Western blotting显示预测的950～1 210 aa肽段与PET32a重组表达的蛋白(MRP)具有良好的免疫原性和反应性;攻毒试验结果表明重组蛋白对小鼠的免疫保护率为菌体免疫所提供保护率的66.7％.研究为利用该细胞表位簇作为高效免疫制剂奠定了基础.     

猪流行性乙型脑炎病毒B细胞多表位抗原的表达及免疫原性分析

流行性乙型脑炎病毒(JEV)可引起猪的繁殖障碍性疾病。本文利用基因重组技术,选取JEV prM/M、E、NS1蛋白的6个B细胞抗原表位,设计B细胞多表位基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达融合重组蛋白rMEP。纯化的rMEP免疫小鼠,通过抗体、中和抗体及亚型检测研究其免疫原性。结果表明,rMEP在上清中高效表达,Western blot结果证实rMEP具有较好的抗原性。在小鼠免疫模型中,rMEP免疫组小鼠血清中产生较高水平的针对rMEP的抗体和特异性中和抗体,且rMEP可诱导产生IgG1和IgG2a抗体,但以IgG1为主。这些结果表明,构建的JEV B细胞多表位蛋白能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答,为研究JEV的多表位疫苗提供新的思路和参考。