猕猴桃溃疡病病菌的多样性及其检测技术

猕猴桃细菌性溃疡病是全球重要的植物检疫性病害，丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种被认为是引起猕猴桃细菌性溃疡病的主要病原菌，准确、快速、灵敏的检测方法对预防其扩散和传播至关重要。本文结合国内外相关研究报道，就猕猴桃细菌性溃疡病菌的多样性及其检测技术进行了系统的综述，重点分析比较了现有不同检测技术的优缺点，展望了猕猴桃细菌性溃疡病菌检测技术未来的发展方向，为准确、快速、灵敏地检测猕猴桃细菌性溃疡病菌提供了基础。     

奉新县猕猴桃溃疡病病原菌鉴定

为明确江西省奉新县猕猴桃溃疡病病原菌种类。从该县7个猕猴桃生产基地采集呈典型症状的发病枝条和叶片,采用稀释分离法对其进行病菌分离并作致病性测定,共获得27个致病性细菌菌株。对各菌株进行培养性状、形态特征观察和生理生化测定,结果与文献中对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)的描述相吻合。提取各菌株基因组DNA,分别对其16S rDNA和16S-23S rDNA基因片段进行PCR扩增、测序、序列分析和构建系统发育树,结果各菌株16S rDNA和16S-23S rDNA序列长度均为1 500 bp和280 bp,且菌株间序列完全一致。将获得的两段序列利用Blast程序分别在GenBank中进行同源性搜索,发现其与丁香假单胞菌猕猴桃致病变种同源性均为100%。待鉴定菌株在系统发育树上与该变种处于同一分支。根据实验结果,将奉新县猕猴桃溃疡病的病原鉴定为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。     

猕猴桃溃疡病病原菌及检测方法研究进展

猕猴桃细菌性溃疡病的发生具有潜伏性、传播速度快、防治困难等特点,目前已经成为一种危害世界猕猴桃生产的毁灭性病害,其病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae,Psa）。综合国内外相关研究报道,就猕猴桃溃疡病病原菌特点、防治、传播及检测等方面进行了系统综述,旨在加深对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的认识,同时为开展该病原菌的早期检测及防治研究奠定基础。     

猕猴桃溃疡病病原菌的分子鉴定和致病力测定

为明确猕猴桃细菌性溃疡病致病菌种类与特征,以从安徽岳西、陕西户县和重庆黔江等猕猴桃主产区收集到的溃疡病感染枝条和树皮为材料,采用平板划线、梯度稀释和BPA培养法分离病原物,采用烟草过敏性反应和猕猴桃健康叶片接种观察其致病性,结合特异引物扩增的16S-23SrDNA-ITS序列分析,对病原菌种类进行分子鉴定。结果表明:从收集的溃疡病感染枝条和树皮中,共分离纯化得到10株分离物;所有分离物均可使烟草叶片产生过敏反应,猕猴桃叶片接种显示同一菌株对不同品种及不同菌株对同一品种的致病力均存在差异。对特异扩增得到的280bp 16S-23SrDNA-ITS序列进行Blast比对分析,结果表明:10个菌株为同一致病菌,其DNA片段大小和序列均与丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae)完全一致。据此可以确定,试验分离所得的菌株均为丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种。     

中药复配物对猕猴桃溃疡病菌抑菌机理研究

【目的】研究由黄芩、石菖蒲和丁香等中药组成的提取复配物对猕猴桃溃疡病菌的抑菌机理。【方法】通过牛津杯法测定中药复配物对猕猴桃溃疡病菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度,并对菌体的生长曲线、细胞壁和细胞膜完整性、胞内DNA含量变化测定,结合细菌电镜透射图,综合分析中药复配物对猕猴桃溃疡病菌的作用机理。【结果】测定得到其最低抑菌浓度为3.125 mg/mL;最低杀菌浓度为12.5 mg/mL。中药复配物可破坏猕猴桃溃疡病菌的细胞壁和细胞膜,使胞内物质溢出,DNA含量降低,还可破坏菌体形态结构,使菌体扭曲变形,生命活性降低。【结论】中药复配物对猕猴桃溃疡病菌有较强的抑制效果,其抑菌机理为影响菌体细胞形态、细胞壁、细胞膜和遗传物质等。     

猕猴桃细菌性叶枯病病原菌和发生规律研究

对猕猴桃细菌性叶枯病的症状进行了描述,并研究了病原菌的形态特征、生理生化特性、侵染循环、传播途径和发病因素。结果表明,该细菌在许多理化特性上与猕猴桃细菌性溃疡病的病原细菌有相同之处,但在形态特征上与溃疡病病原细菌有着明显的差异,该病的病原细菌应该为丁香假单胞杆菌丁香致病变种,该病的发生与品种、气候和管理水平有一定的关系。     

MTT比色法测定烟酰胺类化合物对植物病原细菌的抑菌活性

【目的】探究MTT比色法用于合成化合物对植物病原细菌抑菌活性筛选的可行性。【方法】将7个烟酰胺类化合物分别用MTT比色法和平板扩散法对番茄疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)的抑菌活性进行筛选并测定其有效中浓度EC50。【结果】采用平板扩散法进行抑菌活性初筛时,未能筛选出有活性的化合物;采用MTT比色法筛选出N-(3-三氟甲基)-苯基烟酰胺具有抑菌活性,其对番茄疮痂病菌(X. vesicatoria)、烟草青枯病菌(R. solanacearum)和丁香假单胞杆菌(P. syringae)的EC50分别为3.87、2.05、10.33 mg/mL。【结论】MTT比色法能更加准确地评价脂溶性化合物对细菌的抑菌活性,并具有广泛的应用前景。     

石菖蒲抑菌物质的提取工艺及协同抑菌活性研究

【目的】为了减少猕猴桃溃疡病植物源抗菌药剂的原材料的生产成本，使中药材的利用率最大化，并开发适合针对猕猴桃溃疡病菌的植物源复配抑菌剂。【方法】通过测量不同提取条件下的石菖蒲提取物对猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径，得到石菖蒲的较佳提取工艺，并用响应面分析法筛选出石菖蒲、黄芩、丁香、广藿香、大蒜和牡丹6种中药材组成的最佳复配物。【结果】石菖蒲提取物的较佳工艺条件为：乙醇浓度81.171%、提取温度54.730℃、料液比1∶25、提取温度50℃、超声功率700 W，此条件下的抑菌圈直径可达27.81 mm，复配抑菌剂的最佳配方工艺为：黄芩∶石菖蒲∶大蒜∶广藿香∶牡丹∶丁香=182.310∶306.104∶521.432∶453.106∶153.199∶362.565，在此条件下，1.0 g/mL的复配物实际试验测得的抑制圈直径可达33.860 mm。【结论】确定了石菖蒲提取物对猕猴桃溃疡病菌产生抑菌作用的较佳提取工艺，且同条件下，复配物有更强的抑菌作用。     

丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

 利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中6个致病变种全细胞蛋白电泳,发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致,不同致病变种之间存在差异.以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异,结合营养筛选和血清学方法来进行.对丁香假单胞菌的6个致病变种的全细胞蛋白分析表明:全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种.     

陕西省猕猴桃枝干溃疡病病原菌鉴定

对陕西关中地区猕猴桃枝干及花腐病上分离的5个菌株,经致病性测定、菌体形态、培养性状、生理生化及血清学反应等系统研究表明,病原菌接种温度为15℃左右,伤口入侵,LOPAT试验的+---+,确定陕西省关中地区猕猴桃枝干细菌性溃疡病的病原为丁香假单脆杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv. actinidia).与国内其它地区报道的一致.     

猕猴桃细菌性溃疡病菌T3SS关键效应蛋白基因致病功能

[目的]由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是全球猕猴桃产业最具毁灭性的病害.病原细菌主要通过Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)将多种效应蛋白(T3SS effector,T3SE)注入寄主...     

猕猴桃溃疡病菌噬菌体的初步研究

以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种为指示菌,从猕猴桃溃疡病病枝中分离到一株噬菌体,对该噬菌体进行了热稳定性、pH值稳定性、紫外线稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性的测定。结果表明:噬菌体的热稳定性较弱,在65℃下10 min内即可全部失活;在pH值4~9的范围内噬菌体均可稳定存在;紫外线下照射12 min,噬菌体几乎全部失活;噬菌体的最佳感染复数为0.1;感染指示菌的潜伏期约60 min,爆发期约70 min,烈解量为123。这是首次关于猕猴桃溃疡病菌噬菌体的报道。     

猕猴桃溃疡病综合防治技术

猕猴桃溃疡病属丁香假单胞杆菌细菌,近年来普遍发生,且逐年加重,已成为猕猴桃生产中的一大顽疾,严重影响了猕猴桃产量和品质,阻碍了产业的健康持续发展。因此,必须采取有效措施防治猕猴桃溃疡病。本文现介绍一下猕猴桃溃疡病病综合防治措施,希望能为猕猴桃溃疡病的防治提供些有益的参考。     

噻霉酮对猕猴桃溃疡病菌的抑菌机理研究

【目的】通过测定噻霉酮水乳剂处理后的丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae,Psa）的一系列指标变化，揭示噻霉酮对猕猴桃溃疡病菌的抑菌机理，为噻霉酮防控猕猴桃溃疡病提供理论依据。【方法】对Psa进行稀释10倍的噻霉酮处理（X10），原液噻霉酮处理（Y）以及无菌水处理（CK），利用试剂盒测定Psa抗氧化酶系过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性，考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质量浓度；通过荧光显微镜和扫描电子显微镜观察Psa细胞膜结构的变化；通过流式细胞术进行细胞周期的检测。【结果】噻霉酮处理能明显抑制Psa生长和繁殖，缩短菌体细胞的对数生长期，使细胞膜破裂，细胞内容物外泄，细胞死亡量增加，最终处理组菌体量为CK的5.5%;Psa对噻霉酮存在氧化应激反应，处理后的Psa活性显著升高，呈先上升后下降的趋势。噻霉酮处理后Psa的CAT活性在10 h时到达峰值118.795U/mg,SOD活性在4 h时达到峰值1 060.452 U/mg。X10、Y的菌体蛋白质量浓度在12 h与CK相比差异显著，分别降低了47.1%、7...     

豌豆细菌性疫病菌的分类与检测技术研究进展

由丁香假单胞菌豌豆致病变种引起的豌豆细菌性疫病可引起寄主植物花梗、花和豆荚等萎蔫枯死,导致植株猝倒,对产量影响较大.目前在世界各豌豆重要生产区广泛发生并严重危害,至今尚无有效防治措施.为防范该病菌随着豌豆进口传入我国,需要提高对该病菌的认识,研制更加快速、高效的检测方法.丁香假单胞菌豌豆致病变种与适合致病变种等9个致病变种组成基因型Ⅰ.根据丁香假单胞菌豌豆致病变种与不同豌豆品种致病性的不同,该变种又可分为8个生理小种.利用该病菌特异性片段设计的引物进行PCR扩增产物的不同,可将上述8个生理小种分为2个系统发育群.目前,对该病菌的鉴定主要通过常规的生理生化方法和环介导等温及多位点序列分析等分子生物学方法.上述检测方法存在检测周期长、检测效率低,且不能快速区分阳性结果是否来源于病原菌活细胞或死细胞等问题.可通过探索建立实时荧光PCR和数字PCR检测方法,来实现快速准确鉴定目标菌种,并对供试菌株的活性进行鉴定的目标.     

秦岭北麓猕猴桃主产区溃疡病病原菌的分离与鉴定

为明确秦岭北麓猕猴桃主产区主栽品种猕猴桃溃疡病病原菌致病性强弱与地理来源及品种之间的关系,本研究在周至、杨凌和眉县选择了海沃德、华优和红阳的感病枝条为材料,采用常规组织法对猕猴桃溃疡病病原菌进行分离、纯化,结合16S-23S rDNA ITS序列分析进行分子鉴定,并进行了致病性测定。结果表明:经分离、纯化和分子鉴定,共获得丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae）菌株20个,且不同地理来源和不同品种的菌落形态差异较大;对不同菌株致病性的测定表明,各菌株致病性强弱与其地理来源及品种之间并没有直接的关系;建立基于软件ImageJ 1.50b的定量精确叶片致病性强弱分析方法,筛选出强致病性菌株4个,可为抗性材料鉴定和抗溃疡病专用生物药剂筛选研究奠定基础。     

香辛料提取液对假单胞菌和葡萄球菌及热死环丝菌的抑菌研究

【目的】筛选对假单胞菌、葡萄球菌、热死环丝菌有针对性抑菌效果的香辛料。【方法】应用微生物比浊法研究7种天然香辛料提取液的抑菌性能,应用管碟法测定八角茴香、丁香、肉桂对假单胞菌的最低抑菌质量浓度。【结果】八角茴香、丁香对葡萄球菌的抑菌效果最佳,而肉桂在培养后期,其抑菌效果逐渐明显;八角茴香、肉桂、丁香对假单胞菌的抑菌效果较为明显,以八角茴香尤为显著;八角茴香、丁香、肉桂、甘草和百里香对热死环丝菌均存在一定的抑菌效果,其中八角茴香的抑菌作用最强。【结论】八角茴香、丁香和肉桂对3种供试菌种都存在明显的抑菌效果,其最低抑菌质量浓度分别为0.062 5、0.015 7、0.062 5g/mL。     

小檗内生放线菌H21的鉴定及抑菌活性成分分析

【目的】从药用植物小檗（Berberis thunbergii）中筛选抗菌活性内生放线菌,对活性菌株的分类地位及抑菌活性进行研究,分离并鉴定候选菌株发酵液中活性成分的化学结构及其抑菌活性,为农用杀菌剂的创制提供依据。【方法】采用选择性培养基从小檗叶片分离内生放线菌,16S rDNA法进行菌株鉴定;采用管碟法测定发酵液对烟草青枯病菌 （Ralstonia solanacearum）等7种供试菌的抗细菌活性,采用抑制菌丝生长速率法测定发酵液对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）等7种植物致病菌的抗真菌活性;依次采用大孔树脂吸附、硅胶柱层析及反相高效液相色谱（HPLC）等技术分离纯化活性组分;采用核磁共振波谱（NMR）和质谱（MS）技术对分离到的活性成分进行结构鉴定;采用微量肉汤稀释法测定化合物对烟草青枯病菌等7种细菌的最低抑菌浓度,抑制孢子萌发法和菌丝生长速率法测定化合物对番茄灰霉病菌的抗菌活性。【结果】分离到一株活性菌株H21,该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为链霉菌（Streptomyces sp.）;除铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）外,H21菌株发酵液对烟草青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）等多种病原细菌有明显的抑菌活性;H21发酵液对番茄灰霉病菌表现出较强的抑制菌丝生长作用,对其他供试病原真菌无明显的抑菌活性;从H21菌株发酵液中分离鉴定了3个化合物,分别为N-乙酰基-2-(4-羟苯基)乙胺、环-（L-亮氨酸-L-精氨酸）和二硫吡咯类抗生素-全霉素;全霉素为广谱抗生素,其对烟草青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为0.156、0.313、0.078、0.313、0.156和0.313 µg·mL^-1;对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的抑菌中浓度（IC₅₀）分别为13.56和7.89 µg·mL^-1。【结论】小檗内生菌放线菌H21可能是一种新的全霉素产生菌,其对植物致病细菌烟草青枯病菌和猕猴桃溃疡病菌有抗菌活性,全霉素对于开发针对致病细菌的农用杀菌剂具有重要的参考价值。     

乙蒜素与溴硝醇、代森锰锌2种农药复配对丁香假单胞杆菌的联合毒力

为筛选防治猕猴桃溃疡病的有效药剂,采用抑菌圈法,测定乙蒜素分别与溴硝醇、代森锰锌2种药剂复配对丁香假单胞杆菌的联合毒力,并筛选出最佳组配。结果表明,乙蒜素与溴硝醇以1∶5的比例复配增效作用最好,EC50为0.001 mg/mL,共毒系数为214.7,低于农用链霉素(EC50为0.004 mg/mL);乙蒜素与与代森锰锌以1∶3复配时也具有增效作用,EC50为0.005 mg/mL,共毒系数为205.7。     

枳壳溃疡病致病菌的分离与鉴定

以不同种植基地的枳壳溃疡病叶片为供试材料,采用平板划线法对病原菌进行分离,按照柯赫氏鉴定法则对分离的病菌进行致病性鉴定,通过形态学和16S rDNA序列分析,鉴定枳壳溃疡病致病菌的种类。结果表明：从溃疡病症状的枳壳叶片中共分离得到31株细菌,其中XG7、XGZ1、XGZ2、XGZ3、XGZ8、SH9、SH10、YC1、ZS1等9株为枳壳溃疡病致病菌,菌株类型鉴定为地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri pv. citri),为枳壳溃疡病病原菌的首次报道。研究结果可为研究枳壳溃疡病的发生规律和精准防治提供科学依据。