大通犊牦牛组织线粒体COX酶活性与亚基COX-Ⅰ、Ⅱ mRNA表达的相关性研究

为探讨"大通犊牦牛"组织线粒体COX活性与亚基COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量之间的关系。采用酶联免疫分析法(ELISA)对犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性进行测定;绝对定量荧光PCR(Real-time PCR)检测组织中COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量。结果显示:大通犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性高于乐都犊牦牛;大通犊牦牛组织间COX-Ⅰ基因拷贝数明显高于乐都犊牦牛(P0.05);大通犊牦牛组织间COXⅡ拷贝数以及乐都犊牦牛COXⅡ拷贝数均差异显著(P0.05),大通犊牦牛不同组织中的COX-Ⅰ、Ⅱ的表达量与乐都犊牦牛相比差异显著(P0.05)。结果表明:含野血的大通犊牦牛组织线粒体COX的氧化磷酸化作用要强于家犊牦牛;线粒体COX两种亚基mRNA变化与组织和品种有关;COX活性变化可使COX-Ⅰ、ⅡmRNA发生失调。     

大通牦牛胎盘与胎儿组织线粒体SDH基因分析

旨在探讨高原低氧环境下大通牦牛发育早期线粒体标志酶-琥珀酸脱氢酶(SDH)在不同组织中的表达模式。本研究以大通牦牛妊娠4月龄牦牛及出生1日龄犊牦牛为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术对牦牛胎盘组织,4月龄胎儿和出生1日龄犊牦牛的心肌、骨骼肌、肝和大脑组织中SDHA、SDHB、SDHC和SDHD 4个亚基mRNA定量表达进行测定,研究不同组织线粒体中SDH mRNA表达量与其组织器官能量代谢的相关性。结果显示:出生1日龄犊牦牛心肌组织线粒体SDHA、SDHB、SDHC和SDHD 4个亚基mRNA表达量均显著高于4月龄胎儿;4月龄胎儿大脑组织线粒体SDHA、SDHB、SDHC和SDHD 4个亚基mRNA表达量均显著高于出生1日龄犊牦牛。综上表明:SDH基因表达模式表现为4月龄胎儿大脑组织和出生1日龄犊牦牛心肌组织中SDHA、SDHB、SDHC和SDHD 4个亚基转录水平均表现为上调表达,表明4月龄胎儿大脑组织和出生1日龄犊牦牛心肌组织能量代谢调控活动旺盛。     

不同发育期大通牦牛组织线粒体COX、SDH活性的测定

为了探讨不同发育期牦牛组织线粒体标志酶氧化供能的作用,试验采用酶联免疫分析法(ELISA)对青海省大通种牛场1日龄、1月龄、3月龄、6月龄犊牦牛心肌、骨骼肌、肝脏、大脑组织线粒体细胞色素C氧化酶(COX)、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性进行测定。结果表明:大通牦牛心肌、骨骼肌、肝脏、大脑组织线粒体COX、SDH活性在4个年龄组间差异不显著(P0.05),肝脏组织线粒体COX、SDH活性均高于其他组织。在同一海拔梯度,大通牦牛在发育期心肌、骨骼肌、肝脏、大脑组织线粒体氧化磷酸化作用及有氧代谢能力保持在相对稳定的水平。     

不同地区牦牛心肌、骨骼肌CCO、SDH活性测定

为了进一步从细胞分子水平探讨牦牛高原低氧适应的生物学机制以及为高原疾病的诊疗提供理论依据,试验采用酶联免疫法测定了青海省玛多县、泽库县牦牛的心肌、骨骼肌组织及其线粒体中细胞色素氧化酶(CCO)和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性。结果表明:玛多牦牛心肌、骨骼肌线粒体中SDH活性均高于泽库牦牛,玛多、泽库牦牛骨骼肌线粒体中SDH活性差异显著(P<0.05),泽库牦牛心肌、骨骼肌组织SDH活性均高于其线粒体中SDH的活性,且差异极显著(P<0.01);玛多、泽库牦牛心肌、骨骼肌线粒体中CCO活性差异不显著(P>0.05),泽库心肌、骨骼肌组织中CCO活性显著或极显著高于线粒体中CCO的活性(P<0.05或P<0.01)。在高原低氧环境下,随着海拔的升高,牦牛心肌、骨骼肌组织及其线粒体中SDH活性增强,而CCO有氧代谢保持相对稳定的水平,表明牦牛对高原低氧环境具有显著的适应性。     

“大通牦牛”胎盘-胎儿组织线粒体SDH、CCO和ATP酶活性的测定

为探究牦牛发育早期低氧适应的生物学机制,以"大通牦牛"(海拔3 200 m左右)为研究对象,采用酶联免疫分析法(ELISA)和比色法对妊娠期4月龄牦牛胎盘、胎儿及出生1日龄牦牛组织中琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素C氧化酶(CCO)及三磷酸腺苷(ATP)酶活性进行测定。结果:胎儿和犊牦牛骨骼肌、心肌、肝脏及大脑各组织线粒体SDH、CCO活性差异均不显著(P>0.05);妊娠4月龄胎盘组织和胎儿肝脏组织线粒体中Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP 4种ATP酶活性均高于心肌、骨骼肌、大脑组织,差异显著(P<0.05);出生1日龄牦牛骨骼肌、心肌、肝脏及大脑各组织间4种ATP酶差异不显著(P>0.05),各组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均高于其他ATP酶活性。研究表明牦牛在发育早期组织线粒体中SDH、CCO保持相对稳定的水平,而ATP酶在物质运送、能量转换以及信息传递方面发挥重要的作用。     

不同海拔地区牦牛心肌、骨骼肌线粒体标志酶的测定

采用酶联免疫分析法(ELISA)和比色法对青海省泽库、海晏县牦牛心肌和骨骼肌线粒体标志酶琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)和三磷酸腺苷(ATP)活性进行测定,并与甘肃黄牛进行对比。结果显示:泽库牦牛心肌、骨骼肌线粒体SDH、ATP活性显著高于海晏牦牛和甘肃黄牛(P<0.05),而海晏牦牛和甘肃黄牛差异不显著(P>0.05);泽库、海晏牦牛和甘肃黄牛心肌、骨骼肌线粒体CCO活性差异均不显著(P>0.05)。表明随着海拔的升高,牦牛心肌、骨骼肌线粒体标志酶SDH、ATP表达量增加,肌组织有氧代谢能力增强。     

大通牦牛骨骼肌低氧适应的组织学特点

选取2个海拔高度(3 200、3 700m)大通牦牛作为研究对象,以乐都地区(3 200m)牦牛为对照,利用光镜和计算机图像分析系统测定骨骼肌肌纤维直径、表面积密度;通过透射电镜比较骨骼肌线粒体的面数密度、体积质量、平均体积等结构参数。利用免疫组织化学技术测定骨骼肌组织血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和微血管密度(Microvessel density,MVD)。结果显示:(1)2个海拔高度的大通牦牛骨骼肌肌纤维直径均细于乐都牦牛骨骼肌肌纤维直径,差异显著(P0.05),肌纤维表面积密度,大通牦牛均大于乐都牦牛,差异显著(P0.05);(2)2个海拔高度的大通牦牛VEGF和MVD均高于乐都牦牛的VEGF和MVD,差异显著(P0.05);(3)海拔3 700m的大通牦牛骨骼肌线粒体平均体积、体积质量和面数密度均大于海拔3 200m的大通牦牛和乐都牦牛的平均体积、体积质量和面数密度,差异显著(P0.05)。结果表明:大通牦牛骨骼肌组织有良好的组织遗传学特性,表现出其育种父本的特征及对高原低氧环境的良好适应性,主要表现为肌纤维直径细、表面积密度大、骨骼肌组织VEGF表达量大和MVD大的特点。而骨骼肌线粒体的超微结构,更多的受环境因素的影响,主要表现为高海拔大通牦牛通过增加骨骼肌线粒体平均截面积、平均体积、体积密度和面数密度来提高其在低氧环境中对氧的利用。     

大通牦牛心肌低氧适应的组织学特点

选取两个海拔高度大通牦牛作为研究对象,以乐都地区牦牛为对照,利用光镜技术和计算机图像分析系统测定心肌肌纤维直径、表面积密度;利用透射电镜技术比较心肌线粒体的平均体积(V)、体积密度(VV)和面数密度(NA)等结构参数;利用免疫组织化学技术对心肌细胞血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)进行检测,并对以上数据进行相关性分析。结果显示:(1)大通牦牛心肌肌纤维直径均细于乐都地区牦牛心肌肌纤维直径,肌纤维表面积密度均高于乐都地区牦牛,且三者两两比较差异显著(P<0.05);(2)大通牦牛的VEGF和MVD均高于乐都地区牦牛,差异显著(P<0.05);(3)大通牦牛心肌线粒体的V和VV均大于乐都地区牦牛,差异显著(P<0.05);海拔3 700m的大通牦牛心肌线粒体面数密度大于海拔3 200m的乐都地区牦牛,差异显著(P<0.05)。结果表明,大通牦牛心肌组织主要表现为心肌纤维直径细、表面积密度大、心肌组织血管内皮生长因子和微血管密度大的遗传学特点。而心肌线粒体的低氧适应表现为,随着海拔高度的增加,心肌线粒体平均体积增大,面数密度和体密度增加的特点。     

不同生长期大通牦牛心肌和骨骼肌线粒体抗氧化作用的研究

对青海大通种牛场1、30、180日龄、成年含野血牦牛心肌和骨骼肌线粒体中LDH、SOD活性和LD、MDA含量进行测定。结果显示,牦牛心肌、骨骼肌线粒体LD、MDA含量在年龄组间差异不显著(P>0.05);心肌线粒体LDH活性随年龄的增长呈现递减趋势,骨骼肌线粒体LDH活性在年龄组间差异不显著(P>0.05);牦牛心肌线粒体SOD的活性在年龄组差异不显著(P>0.05),1日龄牦牛骨骼肌线粒体SOD活性最低,其他3个年龄组差异不显著(P>0.05)。表明牦牛在生长发育阶段骨骼肌、心肌线粒体无氧代谢和抗氧化功能保持相对稳定的适应性代谢水平。     

高原牦牛 黄牛心肌及骨骼肌线粒体抗氧化作用的比较研究

采用酶联免疫分析法(ELISA)和比色法对高原牦牛和黄牛心肌、骨骼肌线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)、三磷酸腺苷(ATP)、氧化物歧化酶(T-SOD)及丙二醛(MDA)指标进行测定。结果显示,高原牦牛与黄牛心肌、骨骼肌线粒体ATP、SDH、CCO、T-SOD酶活性及MDA含量差异均不显著(P0.05);高原牦牛与黄牛心肌、骨骼肌胞浆SDH、CCO活性均高于线粒体(P0.05)。