草莓表面典型微生物鉴定、16SrDNA同源性分析及附着能力研究(Ⅰ)

按照草莓生长的3个阶段对四川草莓主产区某生产基地进行2年度连续抽样,对分离的草莓表面微生物进行生化鉴定和16SrDNA测序鉴定;假单胞菌、阴沟肠杆菌2种出现率较高的微生物采用最大简约法(MP)进行同源性分析;并对致软腐微生物进行附着和清洗试验。结果表明,沙雷菌,泛菌属泛菌,少动鞘氨醇单胞菌在草莓青果期出现率较高,假单胞菌,阴沟肠杆菌在各个时期不同地域的草莓均有检出;采摘时间及成熟程度不同草莓表面分离的假单胞及阴沟肠杆菌具有同源性但分子水平仍有差异;清洗试验表明10%的盐水和含氮清洗剂可以改变微生物的渗透压,有效清除表面附着的假单胞菌和阴沟肠杆菌。本试验对草莓表面致腐微生物的研究将为草莓的安全食用提供参考。     

基于Illumina高通量测序技术分析草莓表面微生物结构

为了解不同基地草莓表面微生物的结构特点,在浙江省8个草莓生产基地采集草莓样本,并提取表面微生物DNA样本,利用特异性的引物分别对细菌16S rRNA基因的V3~V4区进行PCR扩增,然后基于Illumina高通量测序技术分析不同基地草莓微生物的菌群结构。结果表明,不同基地草莓表面微生物在门的水平上主要包括变形菌门、厚壁菌门、蓝藻细菌门、放线菌门、拟杆菌门;在属的水平上,优势菌属主要为布赫纳氏菌属、甲基杆菌属和葡糖杆菌属,其中所检出的寡养单胞菌属、苯基杆菌属、埃希杆菌属和葡萄球菌属均具有一定的致病性。由此说明高通量测序技术应用于草莓表面微生物的分析,可在一定程度上提供草莓污染的病原菌信息。     

草莓微生物学检查及肠杆菌和霉菌鉴定

本文在四川草莓主产区成都市草莓生产基的地随机抽取4份样品,对其鲜果和冷藏果进行细菌计数、霉菌计数、大肠菌群检测和常规致病菌检测与分析,结果表明,草莓表面微生物的整体数量较高,冷藏之后微生物数量还稍有提高;试验采用微生物自动鉴定系统ATB鉴定出10种肠杆菌,其中阪崎肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌有一定致病性。采用表型显微观察的方法对分离的4种真菌进行鉴定,其中2种为草莓真菌病害。该结果为草莓生产、食用的微生物危害关键控制和抑菌技术开发提供理论依据。     

健康草莓体内可分离培养微生物的多样性

研究草莓体内能够分离培养的微生物的群落组成和结构,对健康草莓稳态菌群的构建和保持具有重要意义.以健康草莓为研究样本,对其根、茎、叶内的真菌和细菌进行分离培养,分别利用真菌rDNA-ITS引物和细菌16S rRNA引物进行PCR扩增,然后基于测序及其生物信息学分析鉴定微生物种类.结果表明,从健康草莓根、茎、叶部获得了真菌1个门4个属中的14株菌株和细菌3个门6个属中的14株菌株,其中细菌内生菌的多样性高于真菌类群;3个器官中根部内生菌的多样性程度最高;芽孢杆菌(Bacillus)和葡萄孢属(Botrytis)是丰度较高的2个内生菌属.本研究初步明确了草莓不同部位可培养内生菌的分布特点和规律,为探索利用这些内生菌以促进草莓健康生长奠定了基础.     

草莓微生物污染分析及革兰氏阴性细菌和霉菌鉴定

为评估草莓的微生物污染情况,在2016年3—4月份对浙江地区基地温棚和市售草莓进行随机抽样,分析草莓中菌落总数、大肠菌群、霉菌,并运用全自动微生物分析系统(VITEK)和分子生物学技术,分别对分离的革兰氏阴性细菌和霉菌进行了鉴定。结果表明:温棚草莓菌落总数为120~48 600 cfu·g~(-1),大肠菌群为3~1 100 MPN·g~(-1),霉菌为0~2 900 cfu·g~(-1);市场草莓菌落总数为1 900~36 900 cfu·g~(-1),大肠菌群为15~1 100 MPN·g~(-1),霉菌为200~6 100 cfu·g~(-1);同时鉴定出大肠埃希菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、河生肠杆菌(Enterobacter.amnigenus)、植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)等19株革兰氏阴性细菌和毛霉属(Mucor)、镰刀菌属(Fusarium)等5株霉菌,所检出的革兰氏阴性细菌和霉菌多数具有较强的致病性。研究结果为草莓微生物数量的控制和开发杀菌抑菌技术提供了参考。     

松材线虫携带细菌在疫区和寄主中的分布及致病性研究

作者在江苏、上海、广东、安徽、湖北、浙江等疫区 ,采集了呈现松材线虫病典型症状的黑松、马尾松的病样 ,采用病木组织分离法 ,分离获得松材线虫所携带的细菌菌株 2 4株 ,经鉴定 ,2 4株细菌中 ,假单胞菌属有 11株 ,泛菌属有 6株 ,其余有不解糖消化链球菌、河生肠杆菌、乡间步丘菌和粘质沙雷菌 .由此可知 ,假单胞菌和泛菌分布较广 ,在所有采样疫区感染松材线虫病的马尾松和黑松病死木中都能分离到 ,是普遍存在病木组织中松材线虫携带的主要细菌 .致萎活性测定结果表明 :所有假单胞菌属和泛菌属的菌株对无菌黑松切根苗均有致萎活性 .用假单胞菌和泛菌分别与无菌松材线虫混合接种室内无菌黑松苗和野外多年生黑松 ,结果表明 :用细菌单独接种 ,无菌黑松苗和野外黑松均不发病 ,无菌松材线虫单独接种的无菌黑松苗和野外黑松也不发病或发病轻、慢 ,无菌线虫和致萎细菌二者混合接种能使无菌黑松苗和野外黑松发病快且严重 .由此认为松材线虫携带到寄主组织中的假单胞菌和泛菌属的一些种对松材线虫病有明显的协同作用     

根腐病草莓及根系土壤真菌的分离纯化及ITS分子鉴定

为探索根腐病草莓及根系土壤的微生物种类,本文采用稀释涂布平板法和平板划线法对患病草莓根系土壤以及草莓根茎进行真菌分离,并利用ITS基因序列进行分子鉴定。结果表明,从根腐病草莓病株中共分离得到12种不同的真菌,经ITS序列同源性分析,这12种真菌分别属于孢球拖霉属(Gongronella sp.)、黄瓜萎蔫病菌(Plectosphaerella sp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis clavispora)、织球壳菌属(Plectosphaerella sp.)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、盘多毛孢属(Neopestalotiopsis sp.)、青霉属(Penicillium sp.)和梭孢壳属/草根霉属(Thielavia sp.)八个真菌种属。其中孢球拖霉属(Gongronella sp.)、盘多毛孢属(Neopestalotiopsis sp.)和梭孢壳属/草根霉属(Thielavia sp.)为首次在草莓根腐病植株中发现。本文的研究结果为草莓土传疾病根腐病的研究及防治提供了参考资料。     

草莓根腐病病原真菌的分离纯化及ITS分子鉴定

为探索草莓根腐病病株及根际土壤的微生物种类,本文采用稀释涂布平板法和平板划线法对患病草莓根际土壤以及根茎进行真菌分离,并利用ITS基因序列进行分子鉴定。结果表明,从根腐病草莓病株中共分离得到12种不同的真菌,分别属于孢球拖霉属(Gongronella sp.)、棒孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis clavispora)、织球壳菌属(Plectosphaerella sp.)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、盘多毛孢属(Neopestalotiopsis sp.)、青霉属(Penicillium sp.)和梭孢壳属(Thielavia sp.),其中孢球拖霉属(Gongronella sp.)、盘多毛孢属(Neopestalotiopsis sp.)和梭孢壳属(Thielavia sp.)为首次在草莓根腐病植株中发现。本文的研究结果可为草莓土传病害的研究及防治提供参考。     

感病油松针叶中细菌的分离与鉴定

该试验以呼市清水河地区感病油松针叶为材料,分离获得8株菌株.通过16SrDNA序列及同源性比较,结合菌落特征和细菌形态,对菌株进行鉴定,8株菌株分别为绿浅气球菌Aerococcus viridans,解淀粉芽胞杆菌Aerococcus viridans,沙雷菌属Serratia,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,醋杆菌属Acetobacter,变形斑沙雷菌Serratia proteamaculans,不动杆菌属Acinetobacter和蜡状芽孢杆菌bacillus cereua,该8株菌株均不是引起油松疑似病害的微生物.该研究为清水河油松病情诊断和分析提供理论和技术支撑.     

草莓枯萎病病株与健株根际基质真菌群落组成分析

植物根际微生物群落在植物生长发育及病害发生防治方面具有重要作用.由尖孢镰刀菌草莓专化型(Fusarium oxysporum f.sp.fragariae)引起的枯萎病是草莓生产中的典型土传病害,危害极大.旨在揭示草莓植株根际枯萎病真菌群落结构与枯萎病发生之间的关系,从微生物生态学角度对草莓枯萎病的生态防控提供理论依据.以南京地区草莓枯萎病病株和健株根际基质为研究对象,用高通量测序技术检测草莓根际基质的真菌组成.结果表明,草莓枯萎病病株与健株根际基质相比,真菌群落组成发生了显著改变;病株根际基质真菌多样性指数较健株高;病株根际基质中优势属是刺孢菌属,优势种是蚜虫莫氏黑粉菌;健株根际基质中优势属是Pseudothielavia(暂无统一中文名),优势种是Paecilomyces tabacinus(暂无统一中文名);病株根际基质尖孢镰刀菌相对丰度明显高于健株根际基质,提高了14.83倍,表明枯萎病的发生与尖孢镰刀菌含量的大幅度增加密切相关.     

家禽定点屠宰场不同屠宰环节鸡肉表面真菌结构分析

目前鸡肉表面的污染细菌研究较多,而对其表面的污染真菌结构的相关研究甚少,真菌中的酵母菌对于肉鸡的腐败变质有重要的相关性。为了解鸡肉表面污染真菌的结构特征,在浙江省选择1家禽定点屠宰场,于脱毛、净膛、预净、包装和冷藏5个环节各随机抽取5份鸡肉样品,用无菌生理盐水冲洗表面,采集微生物,提取基因组DNA,对真菌ITS区域的ITS2区域进行PCR扩增,高通量测序分析。结果表明,不同屠宰环节鸡肉表面真菌的丰度无显著性差异。屠宰场鸡肉表面真菌主要分布于4个门,优势菌门为担子菌门和子囊菌门,其中担子菌门最丰富,占69%以上。在属的水平上,毛孢子菌属为优势菌属,占63.6%~72.8%。此外,还有病原真菌隐球菌属和曲霉属及腐败酵母假丝酵母属等的检出。本研究为了解定点屠宰场不同屠宰环节鸡肉表面的真菌提供了数据资料,对保障鸡肉的食用安全及改善屠宰场的卫生水平提供依据。     

草莓不同生长时期土壤微生物群落结构变化

为制定草莓的适时施肥计划提供理论依据,采用Illumina高通量测序平台对草莓不同生长时期土壤微生物的群落进行16SrRNA基因(V3-V5区)高通量测序,检测4个草莓不同生长时期的土壤微生物群落结构和丰度。结果表明:测序共获得有效序列数364 968条,OTU数38 124个,归属为10门(Proteobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi, Actinobacteria, Saccharibacteria, Thaumarchaeota, Bacteroidetes,WD272,Gemmatimonadetes,Nitrospirae)和其他未分类的单元;结果期土壤微生物群落的丰度值最大,特有的微生物种类也最多;优势微生物菌群为变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria),生长期和结果期的优势属均为(Candidatus Solibacter),开花期和盛果期的优势属为副球菌属(Rhizomicrobium)。     

秋季罗非鱼及其养殖环境中食源性致病菌菌相分析

[目的]为罗非鱼食源致病微生物的预警和防治提供理论基础。[方法]对秋季广东省不同区域3个养殖场的正常罗非鱼体及其养殖环境中食源性致病菌种类进行调查分析。[结果]罗非鱼及其养殖环境受致病微生物不同程度的污染,分离到的致病菌经初步鉴定为10个菌属,其中以埃希菌属最多,鱼体检出率为67％,养殖环境检出率为100％;沙门氏菌属在罗非鱼体中的检出率（52％）比养殖环境中检出率（39％）高;其次为克雷伯氏菌属、假单胞菌属、链球菌属、变形杆菌、肠杆菌属、金色单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属等。[结论]秋季罗非鱼体及养殖环境正受各种致病菌不同程度的污染。     

微生物菌剂对草莓三种病害的防治效果及其对草莓生长的影响

以草莓（Fragaria ananassa Duchesne）品种红颜为研究对象,以枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、木霉菌可湿性粉剂、复合微生物菌剂3种微生物菌剂作为试材,同时设置25%吡唑醚菌酯悬浮剂作为化学药剂对照、清水对照,研究3种微生物菌剂对草莓炭疽病、白粉病、灰霉病3种病害的防治效果及其对草莓生长的影响。结果表明,3种微生物菌剂均表现出对草莓炭疽病较好的防治效果,均超过65%,且施用复合微生物菌剂的处理防治效果最为明显;在草莓白粉病防治上,施用枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的防治效果最为明显,超过60%,但施用木霉菌可湿性粉剂、复合微生物菌剂处理的防治效果较差,均低于40%;3种微生物菌剂对草莓灰霉病均表现出不同程度的防治效果,为30%～55%。同时,3种微生物菌剂对草莓植株均具有一定的促生作用和增产作用。     

生姜内生菌多样性及微生物拮抗作用的初步研究

[目的]通过对生姜中内生微生物的分离鉴定,了解生姜中内生菌的多样性和功能.[方法]采用5种培养基对生姜根茎块中的内生菌进行了分离,通过形态学分析及ARDRA分析,选择具有代表性的表型进行了16S rRNA基因序列测定及比对分析,并对上述菌进行了微生物拮抗实验.[结果]从生姜中分离获到了23株内生菌,分为8个不同的表型,比对分析确定其分属于Pseudomonas属、Bacillus属、Brachybacterium属、Stenotrophomonas属、Rahnella属,未发现真菌,发现多数菌株具有拮抗作用.[结论]生姜内生菌较为单调,但可能是重要的农用微生物资源.     

锡林郭勒地区紫花苜蓿根腐病原菌的分析

为鉴定锡林郭勒盟白音锡勒地区紫花苜蓿根腐病的致病菌,采用组织分离法获得可培养致病菌群,基于16S r DNA对细菌进行种属分析,基于ITS对真菌进行种属分析。结果表明:在紫花苜蓿根腐部分离鉴定的19株细菌中有6株成团泛菌(Pantoea agglomerans)和6株假单胞菌属(Pseudomonas baetica);所分离的19株真菌中有13株织球壳菌(Plectosphaerella cucumerina)。通过相关文献的分析推测优势细菌成团泛菌和优势真菌织球壳菌为引起紫花苜蓿根腐病的主要病原菌。本研究通过微生物的分离和鉴定揭示锡林郭勒盟白音锡勒地区紫花苜蓿可培养病原菌种类,以期为当地紫花苜蓿根腐病害的诊断和防治提供理论依据。     

低湿度表面的海洋附着细菌对厚壳贻贝附着的影响

从低湿度表面形成自然微生物被膜中分离和纯化出9株海洋附着细菌,并进行细菌16S rDNA基因序列的鉴定以确定其菌名;在18℃、黑暗条件下培养48h后形成单一菌株的微生物被膜,研究了细菌不同初始密度条件下形成微生物被膜的终密度变化及其对厚壳贻贝Mytilus coruscus稚贝附着的影响。同时,将获得的序列与有亲缘关系的序列用Mega软件的CLUSTALW程序进行序列比对和系统发育分析。结果表明:所有测试海洋附着细菌形成微生物被膜的最终密度随初始密度的增加而增加;9株海洋细菌均能不同程度地促进厚壳贻贝稚贝的附着,其中Bacillus sp.2诱导活性最高,其诱导稚贝的附着率为68%;除Pseudoalteromonas sp.3微生物被膜终密度与稚贝附着无显著相关性外(P0.05),其余8株海洋细菌所形成的微生物被膜终密度与稚贝附着均呈显著相关性(P0.05);系统发育分析表明,微生物被膜终密度对稚贝附着的诱导活性与细菌种属无关。研究表明,低湿度表面的海洋附着细菌对厚壳贻贝的附着有明显的促进作用,本研究结果对于今后开展厚壳贻贝稚贝的附着机制研究奠定了基础。     

蜂花粉细菌分离及其致病菌耐药性研究

蜂花既是蜂粮,同时也被人们当保健品食用。为了解蜂花粉产品中可能污染的细菌及其耐药情况,在浙江部分地区采集不同来源和类型的蜂花粉107份,对其可培养细菌进行分离鉴定和耐药性分析。细菌分离参考国家标准方法进行,鉴定通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行,药物敏感性检测通过微量肉汤稀释法进行。结果显示,在107份蜂花粉样品中共分离出38株细菌,分属于10个属20个种,包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、勒克氏菌属(Leclercia)、泛菌属(Pantoea)、肠球菌属(Enterococcus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus),其中包括多株肠杆菌科(Enterobacteriaceae)致病菌。对分离到的克雷伯氏菌进行30种药物敏感性检测,其中6株对氨苄西林具有耐药性,另有1株对头孢唑林具有耐药性,1株对头孢西丁具有耐药性。     

3种核桃寄主对云斑天牛肠道可培养细菌多样性的影响

云斑天牛(Batocera horsfieldi)是一种高度危险的林业蛀干害虫，为了探明云斑天牛的寄主适应机制，本试验以分别取食细香核桃(Juglans sigillata cv.‘Xixiang’)、娘青核桃(J.sigillata cv.‘Niangqing’)和龙佳核桃(J.sigillata cv.‘Niangqing’×J.sigillata cv.‘Yangbidapao’)枝条的云斑天牛成虫为材料，采用传统微生物分离培养与16S rDNA序列分析相结合的方法对云斑天牛成虫肠道可培养细菌进行分离鉴定，研究3种核桃寄主对云斑天牛成虫肠道可培养细菌多样性的影响。结果表明，从取食3种核桃的云斑天牛成虫肠道中共分离出19株细菌，经鉴定归类于2个门(变形菌门、厚壁菌门)9个属[拉乌尔菌属(Raoultella)、肠球菌属(Enterococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、Gibbsiella菌属和假单胞菌属(Pseudomonas)]。G...     

具有解钾活性假单胞菌的分离与鉴定

[目的]分离并鉴定具有解钾活性假单胞菌。[方法]以农田土壤为样本,在钾长石粉为唯一钾源的选择性培养基上分离并纯化解钾菌,并通过形态观察和16S r DNA序列分析对分离到的细菌进行鉴定。[结果]经梯度稀释涂布和平板划线分离,经初筛获得8株生长良好并具有解钾透明圈的细菌。将初筛后获得的细菌菌株进行发酵培养,利用原子吸收分光光度法测定发酵上清液中的速效钾含量,从中筛选出解钾能力较强的1株假单胞菌K3。通过形态观察发现,该菌株为革兰氏阴性杆菌。16S r DNA序列分析结果表明,该菌株与荧光假单胞菌F113亲缘关系最近,初步确定该菌株属假单胞菌属。[结论]该研究为微生物钾肥的开发提供了新的试材。