干扰MSTN对绵羊成肌细胞增殖分化及相关基因表达的影响

旨在探讨MSTN基因对绵羊成肌细胞增殖和分化的作用及相关机制,进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的生物学功能。本研究利用重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞内源性MSTN基因表达,通过CCK-8法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,qRT-PCR检测p21基因表达。成肌细胞诱导分化后利用免疫细胞化学技术检测肌管的形成情况,统计细胞融合率,qRT-PCR检测诱导48、72、96h后MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表达量变化。结果发现,干扰MSTN后成肌细胞的增殖受到抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,并且p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中,发现干扰组与阴性对照组相比,诱导48h4个生肌调节因子的表达量均呈下降趋势,MyoG基因表达显著下调(P0.05);诱导72h干扰组成肌细胞融合率极显著高于阴性对照组(P0.01),Myf5和Myf6基因表达量极显著降低(P0.01),MyoD基因表达量升高不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著增加(P0.01),诱导96h,Myf5基因表达量显著降低(P0.05),MyoD基因表达量降低不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著降低(P0.01),Myf6基因表达量升高不显著(P0.05)。另外诱导72h,HACD1基因的表达量在干扰组中显著高于阴性对照组(P0.05),诱导48和96h无显著变化。研究表明,干扰MSTN表达对成肌细胞的增殖有抑制作用,对分化有促进作用,HACD1基因与成肌细胞融合相关。     

靶向绵羊MSTN基因的锌指核酸酶腺病毒表达载体的构建及活性验证

旨在构建并包装打靶绵羊MSTN基因的位点特异性锌指核酸酶腺病毒表达载体,以借助腺病毒的高转染效率和非整合性以及锌指核酸酶的高效性和特异性实现对绵羊MSTN基因的敲除。本研究利用PCR扩增T2A序列和锌指核酸酶异源二聚体序列,测序鉴定后依次克隆至pAdTrack-CMV,得到pAdTrack-ZFNL-T2A-ZFNR穿梭载体,将之与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转染至BJ5183菌株进行同源重组,以构建pAdEasy-ZFNL-T2A-ZFNR表达载体。然后用上述表达载体转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装,将PCR鉴定阳性的病毒进行扩增并测定病毒滴度。侵染绵羊胎儿成纤维细胞检测重组腺病毒对靶细胞的侵染能力,并用Western blot方法检测绵羊胎儿成纤维细胞中ZFN的表达,进而在细胞水平验证ZFN的活性。结果,包装得到的锌指核酸酶重组腺病毒能够高效侵染绵羊胎儿成纤维细胞并表达ZFN,腺病毒介导的ZFN可识别并切割绵羊MSTN基因。本研究成功获得靶向识别并切割绵羊MSTN基因的锌指核酸酶重组腺病毒。     

RNA干扰INHα基因对绵羊颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响

旨在研究RNA干扰INHα基因对绵羊颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响,明确抑制素对绵羊颗粒细胞的局部调节作用,为今后提高动物的繁殖力奠定基础。选用1.0~1.5岁的小尾寒羊,从卵泡(3~7mm)中分离培养颗粒细胞,将siINHα和siNC(阴性对照)转染颗粒细胞,以未转染的细胞为空白对照(Control),利用脂质体介导法进行转染,荧光定量RT-PCR检测INHα基因的沉默效率、细胞周期和凋亡相关基因的变化,流式细胞仪检测细胞周期的分布变化。结果表明,siRNA转染绵羊颗粒细胞48h后,INHα基因的沉默效率达85%以上。与阴性对照相比,细胞周期相关基因Cyclin D1和CyclinB1mRNA的表达水平分别降低了0.2倍和0.7倍(P0.05),而p21的mRNA表达水平升高了0.9倍(P0.05);细胞凋亡通路中的促凋亡因子Bax、p53和Caspase3的mRNA表达量分别升高了1.8倍、3.6倍和0.4倍(P0.05),而抗凋亡因子Bcl-2mRNA表达量不受影响,阴性对照与空白对照差异不显著(P0.05)。与阴性对照相比,细胞周期的分布显著改变,干扰组G1细胞比例显著升高(P0.05),S期细胞比例显著降低(P0.05),而阴性对照与空白对照间无显著差异(P0.05)。综上表明,INHα作为绵羊颗粒细胞中关键的调控因子,通过调控绵羊颗粒细胞的生长和凋亡参与调控绵羊卵泡排卵的过程。     

绵羊MSTN基因结构和功能的生物信息学分析

为了研究绵羊肌肉生长抑制素(MSTN)基因结构和功能,试验采用生物信息学方法对其编码蛋白的结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、功能分类、二级结构、高级结构和功能结构域进行生物信息学分析并推测与其他物种的生物进化关系.结果表明:绵羊MSTN蛋白是一个疏水性不稳定蛋白,作为信号肽的可能性很大;含有9个α-螺旋、1...     

绵羊MSTN基因结构和功能的生物信息学分析

为了研究绵羊肌肉生长抑制素(MSTN)基因结构和功能,试验采用生物信息学方法对其编码蛋白的结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、功能分类、二级结构、高级结构和功能结构域进行生物信息学分析并推测与其他物种的生物进化关系。结果表明:绵羊MSTN蛋白是一个疏水性不稳定蛋白,作为信号肽的可能性很大;含有9个α-螺旋、11个β-折叠、25个β-转角、1个跨膜结构区域,其功能域可能位于278～375位氨基酸处;绵羊MSTN基因在人、牛、黑猩猩、大鼠、狗、鸡等物种中与牛的亲缘关系最近。     

MSTN基因对牛肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响

为探究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究前期利用定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析野生型蒙古牛（MG.WT）和MSTN^+/-蒙古牛（MG.MSTN^+/-）腿臀肌肌肉组织中蛋白质水平和磷酸化修饰水平的差异变化,使用已建立的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,检测设计合成的MSTN siRNA （si-MSTN）干扰效果;采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测转染si-MSTN的增殖期（GM）和分化第3天（DM3）牛骨骼肌卫星细胞中肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的mRNA和蛋白水平的表达变化,研究敲低MSTN表达对肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响。结果显示,在MSTN^+/-蒙古牛肌肉组织中共鉴定到16个肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因表达丰度上调;转染si-MSTN细胞中的MSTN表达水平极显著降低（P<0.01）;在转染si-MSTN的GM期牛骨骼肌卫星细胞中,肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因ENAH、ACTN4和Cdc42的mRNA水平均显著升高（P<0.05）,PFN1、RhoA和ACTN4的蛋白水平均显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）;在转染si-MSTN的DM3牛骨骼肌卫星细胞中,ENAH、CFL1、SCIN和Cdc42基因mRNA水平均显著升高（P<0.05）,RhoA基因mRNA水平极显著升高（P<0.01）,PFN1和ACTN4的蛋白水平均显著升高（P<0.05）。结果表明,干扰MSTN可以促进肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的表达,探明了MSTN可能通过介导肌动蛋白细胞骨架调节通路影响牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的分子机制,为进一步研究MSTN对牛成肌分化的调控机制提供参考。     

生肌调节因子在绵羊不同胎儿期心肌和骨骼肌中的表达

本试验旨在探究生肌调节因子（myogenic regulatory factors,MRFs）在绵羊不同胎儿发育时期心肌和骨骼肌组织中的表达情况。选取妊娠60（E60）、70（E70）、80（E80）和90 d（E90）4个不同时期的滩羊胎儿作为研究对象,采集骨骼肌和心肌组织,通过HE和油红染色观察心肌和骨骼肌在胎儿发育过程中发生的组织形态学变化;通过实时荧光定量PCR研究绵羊胎儿发育过程中MRFs在心肌和骨骼肌组织中的表达规律以及同一胎儿期MRFs在心肌和骨骼肌中的表达差异。HE染色结果显示,心肌组织和骨骼肌组织的微观结构差异明显,心肌肌纤维密度大,纵横交错成网状,和骨骼肌相比发育的更加成熟;骨骼肌组织肌纤维密度小,间隙大,E60~E90肌纤维数量逐渐增加,肌纤维束结构清晰分明。油红染色结果显示,心肌和骨骼肌组织在4个时期均未出现被染成红色的脂滴,表明E60~E90两个组织均没有分化出脂肪。实时荧光定量PCR结果显示,E60~E90胎儿心肌组织中MYOG、Myf5和Myf6基因表达量持续降低,但是没有MYOD基因表达;E60~E90骨骼肌组织中MYOD、MYOG和Myf6基因表达量持续上升,其中MYOG基因表达水平最高,Myf5基因的表达发生周期性波动。以上结果表明,E60~E90胎儿骨骼肌正处于快速发育阶段,而心肌组织此时已大致成型。因此,骨骼肌组织中MRFs的表达量远远高于心肌组织,且MYOG基因对于维持骨骼肌的快速发育发挥了重要作用。     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3^-/-单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3^-/-细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3^-/-细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3^-/-病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P<0.05),但PK15-IRF3^-/-细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

干扰素调节因子3基因敲除对伪狂犬病病毒增殖的影响

试验旨在研究敲除干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)复制的影响。使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了IRF3基因敲除PK15细胞系。通过构建重组质粒pIRF3-sgRNA,转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定后通过有限稀释法获得PK15-IRF3~(-/-)单克隆稳定细胞系。为验证敲除IRF3基因稳定细胞系是否构建成功,采用实时荧光定量PCR、Western blotting方法检测PRV相关基因及蛋白的表达,应用荧光显微镜和流式细胞术观察病毒复制情况并进行病毒滴度检测。结果显示,PK15-IRF3~(-/-)细胞系感染PRV-GFP后PK15-IRF3~(-/-)细胞荧光强度明显强于PK15细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3~(-/-)病毒滴度明显强于PK15细胞,PRV的gE蛋白水平明显高于PK15细胞。在mRNA水平检测两种细胞中PRV TK基因的变化也得到相同的结果。进一步研究表明,在感染PRV-QXX后,PK15细胞中IFN-βmRNA会随着时间增加显著增高(P0.05),但PK15-IRF3~(-/-)细胞中IFN-βmRNA则无明显变化。上述结果表明,敲除IRF3基因后显著促进PRV的增殖,IRF3在病毒的复制中发挥着重要作用,为伪狂犬病的防控提供了新的方法和策略。     

杜仲皮水提物对虹鳟肌肉生肌调节因子家族（MRFs）基因表达的影响

为了探索杜仲皮水提物对虹鳟肌肉生肌调节因子家族(myogenic regulator factors, MRFs)的调节作用,采用荧光定量PCR法对其m RNA表达量进行检测分析。本研究选取初始体重为(145.56±4.12) g的虹鳟进行试验,设置5个处理组,即在基础饲料中分别添加质量分数为0%(对照组)、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%杜仲皮的水提物,养殖10周。结果显示,杜仲皮水提物对虹鳟肌肉各处理组之间Myf6、MyoD和Myf5基因表达量差异不显著(P>0.05);但是对MyoG基因表达量影响较为明显,其中2.0%组肌肉MyoG基因表达量显著高于各处理组(P<0.05),4.0%组肌肉MyoG基因表达量显著高于对照组、0.5%组和1%组(P<0.05)。杜仲皮水提物可通过调控虹鳟肌肉MyoG基因的表达以实现肉质改善。本研究结果为进一步深入探究杜仲改善养殖动物肌肉品质的分子机理提供了一定的理论依据。     

干扰B-Raf基因对绵羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响

本研究旨在探讨编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/Threonine-Protein Kinase）的B-Raf基因对绵羊毛囊干细胞（HFSCs）增殖和凋亡的影响。将si-B-Raf转染至HFSCs,通过RT-qPCR实验技术检测B-Raf基因、Erk1/2基因和STAT3基因的表达水平,通过Western Blot实验技术检测B-Raf蛋白、Erk1/2蛋白、p-Erk1/2蛋白和STAT3蛋白的表达水平,通过EdU细胞增殖法和CCK-8细胞增殖检测法检测HFSCs的增殖情况,通过流式细胞仪检测HFSCs的凋亡情况。结果表明,si-B-Raf转染细胞后,B-Raf基因的表达量显著降低,Erk1/2基因和STAT3基因的表达量也显著降低;Western Blot实验结果表明,B-Raf蛋白、Erk1/2蛋白、p-Erk1/2蛋白和STAT3蛋白的表达水平显著降低;EdU和CCK-8结果发现细胞增殖受到抑制,细胞增殖水平显著下降;流式细胞仪检测到细胞凋亡水平显著上升。综上,干扰B-Raf基因表达显著抑制HFSCs增殖并促进其凋亡,可能是通过MAPK/Erk1/2通路进行的,研究可为...     

绵羊干扰素调节因子-1基因在COS-7细胞中转染表达的研究

本研究旨在构建真核表达载体pIR ES2-EGFP-IR F1,并在COS-7细胞中过量表达。根据绵羊IRF1基因cDNA序列设计、合成引物,构建真核表达载体pIR ES2-EGFP-IR F1质粒,用电穿孔法,以表达质粒转染COS-7细胞,并用LPS刺激,用定量PCR方法检测IRF1基因的表达量是否升高。结果表明:重组质粒pIR ES2-EGFP-IR F1转染细胞后,可以观察到绿色荧光蛋白的表达,并且可以过量表达,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01),说明通过转染的确会对细胞造成影响,排除转染试剂及未融合GFP的作用后,效果仍然明显。利用LPS刺激后,随着作用时间延长至24 h,IRF1基因的表达量较未用LPS作用的对照组有更高倍数的提高。     

猪干扰素基因在腺病毒的表达及应用

多年来,疫苗免疫接种一直是一种预防大范围传染病暴发的有效措施之一。目前被广泛用来进行免疫控制传染病以及自身免疫病和癌症等疾病的治疗。免疫接种的优点是促使先天性免疫细胞产生免疫记忆细胞,从而使机体针对特定的病原体产生持久的免疫保护。     

牛HSL基因shRNA干扰载体的构建及筛选

HSL基因所编码的激素敏感性脂酶对脂质代谢具有重要的调控作用,不仅能催化水解脂肪组织中的甘油三酯,还能水解不同组织的胆固醇酯,在机体能量供应和类固醇生成中发挥重要作用。为进一步研究HSL基因功能,本试验设计并构建4个HSL基因shRNA干扰载体,并将干扰载体转染到牛胎儿成纤维细胞中以及和设计构建过表达载体共转染到293T细胞中,转染48 h后,分别检测细胞内牛HSL基因的mRNA和蛋白质表达水平,筛选出具有较高干扰效率的shRNA表达载体。结果表明,在牛胎儿成纤维细胞中,4个shRNA载体在转染48 h后,shRNA-731组细胞中HSL基因的mRNA表达量显著低于shRNA NC对照组(P0.05),且干扰效率最佳;同时,在shRNA载体与过表达载体共转染293T细胞中,HSL基因的mRNA和蛋白表达水平显著低于shRNA NC对照组(P0.05)。本研究为进一步探讨HSL基因功能提供了有效工具,也为研究其与牛脂肪代谢相关关系奠定了理论基础。     

shRNA介导的基因沉默表达载体构建方法及应用

shRNA即短发夹RNA,是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,可通过RNA干扰来抑制基因的表达,其干扰原理是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本文综述了shRNA表达载体的构建方法,并对其在生物领域研究中的应用前景进行了探讨。     

绵羊CLPG和MSTN基因多态性及其与生长性状的关联分析

试验旨在探究CLPG(Callipyge)与MSTN(Myostatin)基因作为绵羊生长性状候选基因的可能性,调查与绵羊生长性状相关的分子遗传标记。本试验以133只澳洲白羊×杜泊羊×湖羊杂交绵羊为研究对象,利用PCR产物直接测序及PCR-RFLP技术检测CLPG与MSTN基因的单核苷酸多态性,然后通过SPSS22.0软件GLM统计模型分析多态位点不同基因型及聚合基因型与绵羊生长性状的关联性。测序结果表明,CLPG基因STS序列232bp处检测到C→T突变位点C1,MSTN基因3'UTR区检测到G→A突变位点M1。PCR-RFLP分析显示,C1位点表现为2种基因型:CC和CT;M1位点表现为2种基因型:GG和GA。关联分析表明,C1位点与绵羊背膘厚和眼肌面积显著或极显著相关(P<0.05;P<0.01),M1位点与绵羊体重、管围、背膘厚和眼肌面积显著或极显著相关(P<0.05;P<0.01)。聚合基因型对体重、背膘厚和眼肌面积影响极显著(P<0.01)。研究揭示CLPG与MSTN基因多态性及其聚合基因型对绵羊生长性状具有显著影响,C1和M1位点可以考虑作为绵羊生长性状的有效遗传标记。     

日粮能量对猪肉质性状及MSTN基因表达量的影响

选择杜长大三元杂交猪,采用实时荧光定量PCR技术,研究日粮不同能量对猪肉质性状及抑肌素(MSTN)基因表达量的影响。结果表明:日粮能量对MSTN基因的表达量影响虽不显著(P0.05),但高能量水平有促进MSTN基因表达的趋势;日粮能量对肌内脂肪含量具有显著的影响(P0.05),对肉色、滴水损失及p H值的影响不显著(P0.05);MSTN基因表达量与肌内脂肪含量呈显著正相关(P0.05),与肉色、滴水损失及p H值相关不显著(P0.05)。综上所述,日粮能量水平与MSTN基因的表达对肉质有一定的影响。     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

PRRSV-GP5蛋白对干扰素调节因子-3磷酸化的影响

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)-GP5蛋白对干扰素调节因子-3(IRF-3)磷酸化的影响,试验根据PRRSV CH-1a毒株核苷酸序列,设计并合成用于扩增PRRSV-GP5基因的特异引物,将目的基因扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,转染Marc-145细胞,间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达,应用SDS-PAGE和Western-blot分析GP5对IRF-3的影响。结果表明:经RT-PCR扩增,得到的GP5基因大小与预期一致;间接免疫荧光试验证明,GP5蛋白在Marc-145细胞中成功表达;SDS-PAGE和Western-blot分析显示,GP5基因可以抑制IRF-3的磷酸化。     

VEGF shRNA表达质粒的构建及对绵羊卵泡颗粒细胞增殖的影响

本研究根据绵羊VEGF基因mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,构建表达质粒并通过脂质体介导转染绵羊卵泡颗粒细胞,采用MTT、ALP方法检测VEGF shRNA重组质粒对绵羊卵泡颗粒细胞增殖的影响及Western Blot方法检测VEGF蛋白的表达。结果表明:经酶切和测序鉴定,成功构建了表达shRNA的3条重组质粒;3条VEGF shRNA质粒均可抑制绵羊卵泡颗粒的增殖,VEGF蛋白表达水平也明显降低,从而说明VEGF能够促进绵羊卵泡颗粒细胞的增殖。