犬脂肪间充质干细胞的分离、分化与鉴定

[目的]本试验旨在分离、多向诱导分化并鉴定犬脂肪间充质干细胞。[方法]无菌条件下采取经过健康筛查的犬腹部脂肪,机械剪碎,采用1 g·L~(-1)胶原酶Ⅰ型消化,用DMEM+10%FBS培养,观察细胞形态特征,流式细胞术分析细胞表面抗原标志的表达,并检测其体外成脂、成骨、成软骨分化能力。[结果]运用酶消化法可以从犬新鲜脂肪组织中分离到脂肪间充质干细胞,流式分析结果显示其高表达CD29(99.9%),低表达CD34(0.5%)和CD45(0.3%)。这些细胞在体外经诱导可以分化成为骨、软骨和脂肪。[结论]犬腹部脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞,这些细胞具有多向分化能力。     

羚牛骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

分离鉴定羚牛骨髓间充质干细胞,为开展羚牛细胞治疗与体细胞核移植的深入研究提供有效载体。分离培养来源于羚牛骨髓的间充质干细胞;通过染色体G显带技术进行核型分析;利用流式细胞技术检测细胞表面标记物;通过定向诱导培养探究细胞的分化潜能。结果表明,羚牛骨髓间充质干细胞能够维持正常核型,对间充质干细胞特异性表面标记 CD105、CD73、CD90、CD166、CD44呈阳性,对 CD14(单核细胞和巨噬细胞标记物),CD19(b细胞标记物),CD34(造血干细胞标记物),CD45(泛白细胞标记物)和 HLA-DR均呈阴性,具有成脂、成骨与成软骨多向分化潜能。表明成功分离羚牛骨髓间充质干细胞并对其表面抗原与分化潜能进行鉴定,为羚牛生物多样性保护与内源物种间充质干细胞的应用研究奠定基础。     

鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定

【目的】建立鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定方法.【方法】用I型胶原酶消化法分离天露黄鸡脂肪间充质干细胞(AMSCs),CCK-8检测细胞生长活力,RT-PCR鉴定其特异性标记物,化学法对其进行成脂和成骨分化诱导.【结果和结论】原代及传代的细胞呈成纤维细胞样形态,并能传代至10代,其活力无明显变化;细胞生长曲线呈S型;RT-PCR检测显示AMSCs的特异性标志物CD71、CD44和CD29表达呈阳性,而属于造血干细胞的特异性标志物CD34和CD45呈阴性;AMSCs通过不同诱导液被成功诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,在成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性,过氧化物酶体增殖物激活受体基因γ(PPARγ)和脂肪酸基因(FAS)的mRNA表达量升高;在成骨分化过程中有钙结节形成,茜素红染色呈阳性,碱性磷酸酶(ALP)活性检测对照组与诱导组比较差异显著(P﹤0.05),ALP基因和骨形态发生蛋白基因(BMP2)的mRNA表达量升高.研究表明,鸡AMSCs具有分化为多种细胞的潜能.     

犬骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

为了体外高效快捷地分离培养犬(canine)骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),实验分别用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法对犬BMSCs进行分离培养,利用免疫组化和流式细胞术检测获得细胞的表面标志抗体,并用成骨和成脂方向的诱导分化等方法对其进行鉴定。结果表明,全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法都能成功培养出犬BMSCs,但后者相对前者获得的细胞经培养后其原代细胞分布更均匀,原代培养达到传代所需的时间更短,成活率更高;两种方法获得的P3和P8细胞的生长曲线基本保持一致;免疫组化和流式细胞术检测犬BMSCs表达CD105、CD90和CD29,但是不表达CD34和CD31;且能成功诱导为成骨细胞和脂肪细胞。证明采用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法均能够成功分离和培养犬的BMSCs,而密度梯度离心法是一种较全骨髓差速贴壁法更适合犬BMSCs的分离方法。     

北京油鸡胚胎肝脏间充质干细胞的生物学特性

从7日龄北京油鸡胚胎肝脏中分离间充质干细胞,原代培养并传代至15代,免疫荧光法检测造血祖细胞/肝卵圆细胞的表面标志物CD34、CK19呈阴性表达; RT-PCR检测CD29、CD44、CD71、CD73呈阳性表达。尝试不同培养条件对细胞生长曲线的影响,选取最佳培养方案,同时对细胞进行细胞周期测定。肝脏间充质干细胞通过不同诱导液被成功诱导分化成脂肪细胞、心肌细胞,结果表明,从鸡胎肝中分离获得的间充质干细胞具有和人类间充质干细胞相似的生物学特性及分化潜能,其所具有多向分化的潜能,为今后临床广泛应用提供了可能。     

犊牛脂肪干细胞的分离、培养与鉴定

为给奶牛营养代谢病等相关研究提供种子细胞,本试验从犊牛肾周脂肪组织中分离出脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs),采用组织剪碎法结合0.25%Ⅰ型胶原酶消化法消化、收集原代犊牛ADSCs,通过细胞形态学观察,使用免疫荧光染色法检测第5代ADSCs表面特异性蛋白,并使用CCK-8法测定第5、10代细胞生长曲线,观察第10代细胞的成脂、成骨分化能力。结果显示,分离出的犊牛ADSCs接种4 d后细胞呈成纤维细胞样生长;免疫荧光染色结果显示,分离的细胞Vimentin、CD34、CD44、CD90呈阳性,CD31、CD45呈阴性;该细胞在适当的诱导条件下可以定向分化为脂肪细胞和成骨细胞。本试验分离培养的细胞是犊牛脂肪干细胞,具有成脂、成骨分化能力。     

应用环孢菌素A制备BALB/C小鼠肺癌模型的实验研究

目的 探讨环孢菌素A(CsA)对建立皮下肺腺癌异种移植的BALB/C小鼠模型成瘤率的影响.方法 取50只BALB/C小鼠腋窝皮下接种人肺腺癌细胞系A549后,随机分为实验组和对照组各25只.实验组于接种第24h起每天腹腔注射CsA,连续10天.对照组则给予腹腔注射同体积的生理盐水.比较两组的成瘤率以及胸腺、脾脏重量指数、CD4+、CD8+T移植瘤免疫组化细胞数.结果 实验组移植成瘤率为88.00％,显著高于对照组的52.00％(P＜0.05).与对照组相比,实验组胸腺指数显著降低(P＜0.05),CD4+、CD8+T细胞数以及CD4+/CD8+T细胞比值亦显著降低(P均＜0.01),但脾脏指数差异无显著性(P＞0.05).结论 使用CsA可以提高人肺腺癌细胞系A549制备皮下异种移植的BALB/C小鼠肺癌模型的成功率.     

移植脐带间充质干细胞对荷斯坦公犊生长性能的影响

【目的】探究移植脐带间充质干细胞对荷斯坦公犊牛生长性能的影响。【方法】2013年7~12月选取年龄相近、体重差异不显著荷斯坦公犊28头,随机分为对照组和试验组。将培养成功的脐带间充质干细胞按公犊体重×105个/kg干细胞稀释至8 m L颈静脉注射至其体内,对照组注射等量生理盐水。空腹测体重、体高、体斜长、胸围、管围和腰角宽,采血3 500 r/min离心15 min保存血清待检,共6次。【结果】培养出脐带间充质干细胞;4、5、6月龄时,试验组平均体重显著高于对照组(P<0.05);4月龄时,试验组平均日增重显著高于对照组(P<0.05);6月龄时,试验组平均日增重极显著高于对照组(P<0.01)。试验组各项体尺指标在公犊生长发育高峰期时均高于对照组,且差异显著(P<0.05)。试验组血清中P含量在3、4、6月龄时显著高于对照组(P<0.05)。试验组血清中Ca含量在5、6月龄时显著高于对照组(P<0.05)。【结论】注射脐带间充质干细胞能够显著增加荷斯坦公犊牛的发育速度,有效的增加其生长性能。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及鉴定

为了建立一种体外培养兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)的方法,在无菌条件下取家兔双侧腹股沟脂肪垫,Ⅰ型胶原酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM 培养液培养.细胞连续传代后,MTT法检测第3、5、10代细胞的增殖情况.采用油红染色法和Von Kossa染色法观察第3代ADSCs向成脂和成骨方向分化情况,并采用流式细胞仪分析细胞表面标志.结果显示,第3、5、10代的ADSCs生长曲线并无显著差异,细胞增殖较快;ADSCs成脂诱导后油红染色阳性,成骨诱导后Von kossa染色形成典型的黑色钙化结节.ADSCs 表面标志检测结果为:CD29 和CD90阳性,CD45和CD80阴性.成功分离和培养了兔的ADSCs,其具有成脂和成骨潜能,可作为组织工程的种子细胞.     

无血清扩增犬脐带间充质干细胞治疗犬急性肾损伤研究

为研究无血清扩增犬脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)移植对犬急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的临床治疗效果,采用胶原酶消化法分离犬UC-MSCs,无血清对其进行体外扩增,对P3代干细胞的形态、生长曲线、群体倍增时间、体外诱导分化和表面标记基因表达等生物学特性进行鉴定;通过静脉注射P3代无血清犬UC-MSCs对1例急性肾损伤的犬进行治疗。结果表明:无血清犬UC-MSCs原代48h发现有少量细胞贴壁,呈不规则形态。P3代犬UC-MSCs贴壁生长,呈长梭形或多边形等形态,P3代细胞较P6代细胞有更强的增值能力,在体外经诱导可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞。病犬就诊前精神沉郁、脱水并伴有呕吐及腹泻等症状,经血液生化检查,该病犬肌酐389μmol·L^-1、尿素>46.4mmol·L^-1、无机磷4.40mmol·L^-1,结合血常规及超声检查,确诊为犬急性肾损伤。在常规治疗联合干细胞移植后34d进行复查,病犬精神恢复良...     

胸膜肺炎放线杆菌感染对猪外周血T淋巴细胞亚群及增殖影响

为研究感染APP对猪外周血免疫功能影响,将24头健康杜洛克、长白猪和约克夏三元杂交(DLY)仔猪按性别、体重分为2组,分别用生理盐水(对照组CG)和含3.8×107CFU.mL-1猪放线杆菌(APP)稀释液(试验组TG)喷雾鼻腔。结果表明,TG猪血液中白细胞总数(WBC)、中性粒细胞数(GRA)、中间细胞数(MID)均极显著升高(P<0.01),淋巴细胞数(LYM)却极显著降低(P<0.01)。TG猪外周血CD3+T细胞降低(P>0.05),CD3+CD4+T细胞极显著降低(P<0.01),CD3+CD8+T细胞及CD4+/CD8+值显著降低(0.010.05)。结果表明,感染放线杆菌后,猪整体防御机能和呼吸道粘膜局部免疫功能增强,而机体整体免疫功能下降。     

绵羊脐带间充质干细胞的分离、体外培养及诱导分化

通过多重酶混合消化法和胰酶消化筛选法体外分离、纯化及培养绵羊脐带间充质干细胞(MSCs),并观察其生物学特性,以此建立绵羊脐带间充质干细胞的分离培养流程.试验采集健康的哈萨克羔羊脐带组织,剔除血管后剪碎,添加复合消化酶消化24 h得到细胞,胰酶消化法筛选除杂并观察细胞形态,绘制第1代、第5代及第10代细胞生长曲线;取第10代细胞检测其体外诱导成骨细胞能力和诱导成脂细胞能力,cAKP染色检测其分化状态.结果表明,获得的细胞经传代培养达10代后无明显的形态和增殖能力改变;体外诱导成骨细胞和成脂细胞试验证明其具有被诱导分化成骨细胞和脂肪的能力,cAKP染色证明其处于未分化状态.试验获得的绵羊脐带间充质干细胞能在体外培养、扩增并且具有和骨髓间充质干细胞类似的生物学特征.     

大豆黄酮对仔猪生产性能及血液生化指标的影响

研究了大豆黄酮对仔猪生产性能的影响,并对有关血液生化指标进行了分析,以探讨大豆黄酮对仔猪促生长机理。试验结果表明:添加大豆黄酮使仔猪平均日增重提高、料重比降低(P>0.05)。大豆黄酮20mg/kg组使血清T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群比例均显著提高,各组CD4+/CD8+值、T淋巴细胞转化率有提高的趋势(P>0.05)。血清SUN浓度呈降低趋势(P>0.05)。20mg/kg组血清T3含量显著提高,10和30mg/kg组T3含量、各组血清T4含量、血清睾酮和雌二醇含量、血清皮质醇浓度均有提高的趋势(P>0.05)。血清MDA含量则呈降低势(P>0.05)。可见添加大豆黄酮可提高仔猪的生产性能,改善仔猪的细胞免疫水平和机体氧化状态。     

骨髓间充质干细胞移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中应用

探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中的应用价值。通过一次性腹腔注射环磷酰胺和白消安建立小鼠卵巢早衰(POF)模型,并随机分为建模组、BMSCs移植组和空白对照组。移植组于建模14 d经尾静脉注射绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠BMSCs悬液(5×10~7个·mL~(-1)),每4 d重复1次,共5次;建模组和空白对照组注射等量生理盐水。观察建模后及BMSCs移植后小鼠的一般情况、血清FSH和E2水平、卵巢组织学变化以及GFP荧光信号在卵巢内的分布。结果发现,建模组小鼠食欲明显减退,活动减少,与空白对照组相比体重显著减轻(P0.05),FSH水平显著增高(P0.05),E2水平显著降低(P0.05),卵巢体积减小,间质纤维化严重,始基卵泡、生长卵泡和成熟卵泡数均显著减少(P0.05)。BMSCs移植后,移植组小鼠体重增加,食欲增强,活动增多;28 d后FSH浓度显著低于建模组(P0.05),E2浓度、始基卵泡、生长卵泡数及成熟卵泡数均显著高于建模组(P0.05),但各项指标仍与空白对照组间存在显著性差异;荧光显微镜下可见绿色荧光信号散在分布于卵泡周围。此结果提示,BMSCs可在小鼠损伤卵巢组织中定位存活,对卵巢组织结构及内分泌功能有修复作用。     

荷斯坦牛脐带间充质干细胞分离鉴定及分化研究

动物干细胞作为重要遗传种质资源和再生医学的可行性资源，拥有广阔研究和应用前景。对荷斯坦牛脐带细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）进行分离、鉴定，并对其多向分化潜能等生物学特性进行研究。取3月龄健康荷斯坦牛胎牛脐带，采用Ⅳ型胶原酶分离细胞进行体外培养，获得的细胞贴壁后呈长梭形，生长曲线呈典型的“S”形，群体倍增时间随着代次的升高逐渐下降。免疫荧光和RT-PCR的检测结果都表明，分离的细胞中CD29、CD73、CD90、CD166均阳性表达，而CD45不表达。成脂肪诱导后，可见被油红染色液染色的脂滴，成脂肪关键基因LPL和PPAR-γ都阳性表达；成骨诱导分化后，可见被茜素红染色的钙结节，其表达成骨关键基因骨桥蛋白OPN和Ⅰ型胶原蛋白基因COL-Ⅰ；成软骨诱导分化后，可见被阿利新蓝染色的软骨组织，表达成软骨细胞关键基因转录因子基因SOX9和ACAN。成功从3月胚龄的荷斯坦牛脐带中分离出其具有良好的增殖活力及成脂肪、骨和成软骨能力的间充质干细胞，可为动物种质资源保存和再生医学提供依据和潜在可利用细胞资源。     

加味四君子汤对脾虚犬生理生化指标及消化吸收功能的影响

【目的】探究加味四君子汤对脾虚犬相关指标及功能的影响,为临床脾虚犬的治疗提供参考。【方法】选择24只1岁龄的比格犬,随机平均分为4组,分别为对照组、脾虚组、自然恢复组、加味四君子汤恢复组。对照组犬饲喂基础饲粮;其余3组犬先饲喂基础饲粮并每天灌喂6 mL/kg番泻叶水煎液,上下午各1次,构建脾虚模型。模型构建成功后,将脾虚组犬解剖采样,加味四君子汤恢复组饲喂添加加味四君子汤的饲粮(每50 g添加1 mL),自然恢复组饲喂基础饲粮。分别在第0,7,14天采血,测定血常规指标(白细胞(WBC)数、淋巴细胞(LYM)数、中性粒细胞(Gran)数、红细胞(RBC)数、血红蛋白(HGB)含量、红细胞压积(HCT)、血小板(PLT)数),并分离血清测定生化指标(丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、胆红素(TBIL)含量)以及D-木糖含量。第14天,全部犬解剖采集小肠和胰腺组织,观察小肠形态并测定胰腺消化酶活性。【结果】番泻叶水煎液灌喂第7天,试验犬出现脾虚证候群,表明脾虚模型构建成功。第0天时,各组犬各类指标均无显著差异。第7天时,与对照组相比,脾虚犬体质量极显著降低(P0.01);血液中WBC、LYM数量,血清TP含量及胰腺组织中淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶活性显著降低(P0.05),RBC数量、HGB含量、HCT及血清ALB、GLU、D-木糖含量极显著降低(P0.01),ACT活性显著升高(P0.05)、胆红素含量极显著升高(P0.01)。电镜观察发现,脾虚组犬小肠绒毛稀疏且部分断裂、缺损,细胞器结构损伤。第14天时,脾虚犬经加味四君子汤治疗后,各项指标均恢复到对照组水平。【结论】加味四君子汤能够使脾虚犬的生理生化指标及消化吸收功能恢复正常,对犬脾虚证有明显治疗效果。     

长江刀鲚生殖洄游过程中血清能量指标变动

为探究刀鲚(Coilia nasus)生殖洄游过程中血清能量指标的变动情况,于2019年4月15日 ~ 6月5日,在长江崇明段、镇江段和安庆段使用刺网采集刀鲚,对49尾刀鲚血清样本的能量指标进行测定分析。结果显示,自崇明至安庆的洄游过程中血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白含量均无显著差异(P>0.05),血清总蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白和游离脂肪酸含量在镇江至安庆段均无显著差异(P>0.05),出现显著差异的过程主要集中在崇明至镇江段,总蛋白和甘油三酯含量显著降低(P<0.05),分别下降19.36%和29.29%;高密度脂蛋白和游离脂肪酸含量显著升高(P<0.05),分别上升60.38%和23.65%;安庆段卵巢发育至不同时期的刀鲚样本中,Ⅳ期样本的甘油三酯含量于Ⅱ期和Ⅲ期样本均存在显著差异(P<0.05),分别上升67.24%和53.75%,其余指标在各发育期样本间均无显著性差异(P>0.05)。综上所述,自崇明至镇江段,刀鲚血清样本甘油三酯、高密度脂蛋白和游离脂肪酸等血脂相关指标出现显著性变化(P<0.05),表明刀鲚在洄游前期脂质代谢活跃,脂肪应是其洄游及发育的主要供能物质;自镇江至安庆段,其代谢水平对洄游及性腺发育的能量需求逐渐适应,因此洄游后期刀鲚血清能量指标总体趋于平稳。     

骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血的动物实验研究

    探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对大鼠脑缺血的修复和治疗.体外分离培养大鼠MSCs,以Hoeschst33342标记,移植到大脑中动脉梗塞(MCAO)模型的大鼠体内,分别设立缺血1 d和缺血7 dMSCs移植组与缺血对照组,对各组大鼠进行神经功能损害严重程度评分(NSS)及大脑组织切片观察比较.结果发现,缺血1 d MSCs移植组大鼠NSS评分低于另外两组,差异显著(P＜0.05),大脑组织结构清晰、完整,胶质瘢痕少;缺血7 d MSCs移植组与对照组无明显差异(P＞0.05).故缺血早期进行MSCs移植,大鼠神经功能恢复情况明显.MSCs在损伤后的脑组织内能够存活并且分化为神经元、胶质细胞等,对动物神经损伤后组织重建及功能恢复有一定的治疗作用.     

梅山猪骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析

为建立梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养方法及对梅山猪BMSC的生物学特性进行分析,本研究采用全骨髓法分离培养并传代梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以计数法检测细胞增殖状况,流式细胞术检测细胞周期,细胞压片进行染色体分析,免疫细胞化学和RT-PCR法检测细胞表面标志和转录因子的表达情况,并检测成骨和成脂分化能力.结果显示:梅山猪BMSC体外生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,具有稳定分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志基因及Fou5F1、Sox2、Nanog等转录因子基因表达呈阳性,CD45、Lin28表达呈阴性;在特定诱导液作用下,BMSC可分化为成骨样细胞及成脂肪样细胞.采用全骨髓法成功分离培养出大量纯度较高的梅山猪BMSC,其生长状态良好,可作为后续BMSC相关研究的种子细胞.     

奶牛脐带间充质干细胞的体外培养与鉴定

[目的]在无菌环境下截取新生牛脐带20 cm,在体外进行原代奶牛脐带间充质干细胞分离培养,建立原代奶牛脐带间充质干细胞分离、培养、传代的方法,并进行形态学观察和多向分化能力检测.[方法]采用多重酶混合消化法,分离出原代奶牛脐带间充质干细胞,通过倒置显微镜下观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,向成脂、成骨诱导分化.[结果]培养出了奶牛脐带间充质干细胞.倒置显微镜下观察,细胞形态呈相对均一的梭形,平行排列生长或呈旋涡状生长.能够诱导分化为成脂、成骨细胞.细胞增殖能力强,可多次传代.[结论]胰酶消化法能够快速分离出原代奶牛脐带间充质干细胞,所获得的细胞纯度较高,具有一般间充质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能.