犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析

试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础。从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体。序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80%,CPV-2b型占20%。本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低。Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性。该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据。     

犬细小病毒VP2截短基因的原核表达及表达蛋白抗原性分析

采用PCR方法扩增了犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）2段VP2截短基因,将2段短基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,表达质粒命名为pET-32a-306和pET-32a-363。将pET-32a-306和pET-32a一363转化至宿主菌E．coliBL21（DE3）,IPTG诱导后进行SD孓PAGE和Westernblotting分析。结果显示,融合蛋白相对分子质量大小为30000和33000;与全长VP2蛋白相比,目的蛋白得到了高效表达,且都为可溶性表达。West—ernblotting结果表明,该蛋白融合表达并且有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。     

鹅细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达及纯化

将鹅细小病毒 (GPV) VP2基因插入原核表达载体 p PROEX- HTb,获得重组表达质粒 p PROEX- HTb- VP2。将其转化大肠杆菌 DH5α,用 IPTG诱导表达 ,表达菌体蛋白中可产生与预期大小相符的约 72 0 0 0的蛋白。以光密度扫描对该表达产物进行定量分析 ,表达产物约占菌体总蛋白的 14 %。经 His- tag金属螯合层析纯化 ,获得纯度较高的 6 His- VP2融合蛋白。 Western- blot结果表明 ,所得蛋白与鹅抗 GPV高免血清有较好的免疫反应性 ,说明在 VP2的 N端融合 6个组氨酸不影响其与特异抗体结合的活性。     

犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定

犬细小病毒(CPV)编码的VP2基因容易发生变异,导致病毒嗜性和致病性的改变。为制备一株高致病性的CPV毒株(NY株,基因型为2a型)重组VP2蛋白,构建重组原核表达载体pET28a-CPVVP2,转化E.coli BL21(DE3)表达菌株,通过不同温度、不同IPTG浓度和不同诱导时间等条件的优化进行表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果表明,重组CPV-NY毒株VP2蛋白(rVP2)的分子质量约为72ku,在不同温度条件下均以包涵体形式存在,在37℃条件下以终浓度为0.2mmoL/L IPTG诱导4h表达量达到最高。rVP2不仅与His标签mAb反应,也能与CPV特异性阳性血清反应,说明rVP2具有良好的反应原性,为CPV抗体检测试剂盒和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建

将鹅细小病毒VP2基因在克隆到原核表达载体pPROEX-HTb及真核转移载体pFASTBAC-HTb中，重组真核转移载体在DH10BAC中经转座作用，成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX-HTb-VP2和杆状病毒表达载体BAC-VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析，确定为阳性重组子。     

犬细小病毒VP2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立

以犬细小病毒(Canine parvovirus virus,CPV)VP2基因的原核表达产物为抗原建立检测CPV抗体的间接ELISA方法.在分析CPV VP2基因稀有密码子(大肠杆菌系统)的基础上,克隆去除5'和3'端的稀有密码子的VP2基因,构建了VP2蛋白原核表达载体pET28a-VP2和pET32a-VP2,利用HIS标签对融合表达产物进行纯化.经SDS-PAGE和Western-blot检测证实该基因获得表达,并存在低相对分子质量产物,其中纯化后的pET28a-VP2具有良好的免疫学活性.以pET28a-VP2蛋白为基础,建立检测VP2抗体的iVP2-ELISA方法:抗原包被质量浓度为17.8 mg/L,血清最佳稀释度为1:20,阳性判定标准初步定为:待测样品D值>0.367,且待测样品D值/阴性样品D值>2.0.采用iVP2-ELISA对20份背景清晰的犬血清样品进行检测,结果显示,iVP2-ELISA与HI试验的阴阳性符合率一致,但不呈现正比关系.本试验为犬场CPV抗体水平检测和进行CPV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(+),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus, CPV) VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(＋),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒（CPV）VP2蛋白基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET一30a载体中，构建了原核表达载体pET—VP2，转化大肠杆菌Rosetta，表达并纯化了重组蛋白，Western—blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15．8ng／孔，血清的最佳稀释倍数为1：100，建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

吉林省犬细小病毒流行毒株的分离及VP2基因序列分析

为了解吉林省宠物医院就诊犬犬细小病毒流行现状及毒株变异情况,从吉林省长春、吉林、辽源、松原、九台地区采集就诊犬肛门拭子73份,采用胶体金快速检测试剂盒检测后,阳性样品15份。选取具有代表性的6份病料使用F81细胞进行病毒的分离,成功分离到6株病毒(暂命名为JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY),经通用引物鉴定均为犬细小病毒。VP2基因序列分析结果显示,6株CPV分离株之间的核苷酸同源性为99.3%~100%,与近年来国内分离株核苷酸同源性为98.9%~99.9%,与国外分离株核苷酸同源性为98.3%~99.7%。遗传进化树结果表明,6株分离株分属4个分枝:JL-CC1、JL-LY、JL-SY与山东、辽宁分离株同属1个分枝,JL-CC2与黑龙江分离株同属1个分枝,JL-JT与吉林分离株同属1个分枝,JL-JL与2013年吉林、黑龙江分离株同属1个分枝。氨基酸序列比对显示6株分离株JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY属于New CPV-2a基因亚型,JL-JL株为属于New CPV-2b基因亚型。此外,6株CPV分离株在267、324、377、440位氨基酸发生了变异。结果表明,吉林省CPV以CPV-2a亚型为主,CPV-2b亚型为辅,并存在基因多变现象,可为吉林省CPV的有效防控提供数据支持。     

Analysis of Clone and Prokaryotic Expression of Canine Parvovirus VP2 Gene

The study was aimed to investigate the epidemic situation of canine parvovirus in Hebei and Gansu provinces.VP2 protein was expressed by prokaryotic system and polyclonal antibodies were prepared, which provided a basis for the further researches on pathogenesis and therapy of canine parvovirus.Virus genomic DNA was extracted from 10 epidemic materials of suspected infected dogs and VP2 gene was amplified.The target fragments of VP2 gene were cloned to pET-30a vector after sequencing and analysis, then the positive expression plasmids were transformed into E.coli BL21 (DE3) cell.Polyclonal antibodies were prepared by immunizing guinea pigs with the SDS-PAGE identification of purified protein.The genetic analysis results showed that the VP2 gene was successfully cloned and 80% samples were belonged to CPV-2a and 20% samples were belonged to CPV-2b.The isolated strains of the test and part of China strains were gathered into a branch which had certain distance with strains of Korea and USA, and that had low homology with strains of Italy.SDS-PAGE results indicated that the recombinant protein with a molecular weight of 70 ku was expressed by prokaryotic system.Western blotting results showed that the recombinant protein had good immuneoreactivity and immunogenicity.The study indicated that CPV-2a was the predominant gene type in Hebei and Gansu provinces, meanwhile VP2 protein expressed by prokaryotic system had good antigenicity.This research provided a basis for the future study of the prevention and control of canine parvovirus.     

犬细小病毒特异性抗血清的制备及应用研究

为制备犬细小病毒特异性抗血清,用犬细小病毒DD株免疫健康易感比格犬,无菌采血后分离血清制备犬抗CPV-2血清。通过SN、ELISA、IFA、HI方法对制备的血清进行检测,未检出犬类常见的5种病毒抗体,说明该血清特异性良好。经测定,该血清中和抗体效价为1∶512;HI效价为1∶1280。应用结果表明,该血清对不同犬细小病毒毒株中和能力相当,对CPV-2感染犬有良好的治疗效果。     

兰州市犬瘟热、犬细小病毒病及犬副流感的感染调查分析

为查清兰州市宠物犬犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感的感染情况,本研究对2004年~2009年前来宠物医院就诊的有临床症状的犬进行检测,共采集犬瘟热疑似病犬眼鼻分泌物、唾液2238份;犬细小病毒病疑似病犬粪便2423份;犬副流感疑似病犬眼、鼻分泌物334份。用快速检测试纸卡进行检测,结果显示兰州市宠物犬犬瘟热平均阳性率达27.52%,自2004~2009年间呈逐渐下降趋势。犬细小病毒病平均阳性率为25.88%,自2004~2008年间呈逐渐下降趋势,2009年略有反弹。首次证实犬副流感在兰州市宠物犬中流行,其中犬副流感病毒平均阳性率为37.72%,犬腺病毒Ⅱ型平均阳性率为19.46%,从流行周期看,2004年以犬副流感病毒感染为主,2005年以犬腺病毒Ⅱ型感染为主,而后连续两年以混合感染为主,到2008年又以犬副流感病毒感染为主,2009年再次以混合感染为主。     

应用电镜技术和血凝试验检测犬细小病毒和犬腺病毒

电镜技术和血凝试验是检测犬细小病毒和犬腺病毒快速而简便的方法。本试验结果表明,两种方法检验结果大部分相符,但各具特色。电镜技术的优势在于能够直观地显示目标病毒的生长发育、粒子的完整性以及有无非目标病毒、细菌、支原体等污染情况,这对于动物病毒疫苗种毒质量的检测是十分重要的。     

云南省犬细小病毒VP2基因检测分析

为了解云南省犬细小病毒VP2基因分子流行变异情况,对来源于云南省7个地级市13个犬细小病毒样品进行了VP2基因的扩增和序列分析,并与相关参考序列进行了遗传进化比对分析。结果表明,13个样品中9个基因型为CPV-2a,3个基因型为CPV-2b,1个基因型为CPV-2。氨基酸序列变异主要集中在297位-518位氨基酸处,其中324位和440位氨基酸变异在犬细小病毒进化过程中扮演着重要角色。遗传进化分析显示10个样品序列形成了一个相对于国内外参考序列独立的遗传进化分支,提示云南省犬细小病毒以CPV-2a基因型流行为主。     

犬细小病毒的分离鉴定与生物学特性分析

本研究旨在获得华中地区的犬细小病毒分离株并对其基因型分型、生物学特性及致病力进行探讨.从武汉部分宠物医院采集胶体金初检阳性的14份可疑病料,用猫肾细胞(F81)进行病毒分离.根据犬细小病毒2型(CPV-2)保守的VP2,先后设计2对引物,进行PCR扩增.在细胞上对其进行空斑纯化,进行一步法生长曲线测定,并进行电镜观察.最后对这5株病毒都进行动物回归试验.细胞传代结果表明得到5株细小病毒.PCR扩增结果表明获得390和583 bp 2个片段.将2个片段测序的结果与GenBank发布的CPV-2比对,表明所获得的5株病毒中,有4株属于2a型,1株属于2b型.空斑纯化及生长曲线绘制结果表明分离毒株增殖滴度可达105.5PFU·mL-1.电镜观察结果表明,感染细胞的线粒体肿胀.动物试验结果表明犬都能表现不同程度的发病状况,大体解剖发现肠管有坏死、心肌变薄.将病变的心脏制作切片观察,结果表明心肌细胞变性、坏死.本研究结果为进一步研究CPV-2的分子生物学和分子致病机理奠定了基础.