随机扩增多态性DNA的重复性和可靠性问题

随机扩增多态性DNA分子标记技术,由于其在基因定位、遗传标记、基因图谱构建、种群亲缘关系和系统进化等研究方面具独到之处及快速方便的特点而得到广泛应用。本文作者结合工作中的体会就RAPD的重复性和可靠性问题进行讨论。     

不同地区小菜蛾种群的抗药性及酯酶同工酶的研究

用淀粉凝胶电泳对中国 3个不同地理区域的小菜蛾种群和台湾敏感品系的抗性水平及酯酶同工酶进行了研究 ,结果发现 :生物测定显示 3个小菜蛾种群对杀虫双均没有明显的抗性 ;对阿维菌素的抗性分别为 1.2 1倍、4 .51倍和 1.2 5倍。在 Estα和 Estβ基因位点 ,北京种群中存在 11种同工酶 ,其中 4种为 α同工酶 ,7种 β/i>同工酶 ;河北种群中存在 3种 α同工酶 ,5种 β同工酶 ;云南种群中存在 3种 α同工酶 ,3种 β同工酶。 3个种群酯酶基因多态性的产生可能是携带不同抗性酯酶基因的小菜蛾被动运输的结果 ;杀虫双对于能引起酯酶活性升高的杀虫药剂可能无交互抗性。     

小菜蛾抗药性分子遗传机理的探讨与分析

采用核型分析和代表性差异分析方法,探讨了小菜蛾抗药性的分子遗传机理.结果表明,敏感品系和抗性品系小菜蛾的染色体数目均为2n=30条,两者的核型无明显差异;以敏感品系作为驱赶扩增子,抗溴氰菊酯、抗杀虫双、抗杀螟丹近等基因系分别作为检测扩增子进行消减杂交和差异片段的富集.最后随机选取部分差异片段作探针,Southern blot验证,分别在抗杀虫双、抗溴氰菊酯和抗杀螟丹近等基因系中筛选出2、2和3个特异片段.从研究结果可以看出,与敏感品系相比,三种抗性品系小菜蛾的核型没有发生明显的变化,但在DNA水平上存在明显的差异,说明小菜蛾的抗药性与基因组DNA的变化有关.     

小菜蛾溴氰菊酯抗性和敏感种群遗传差异的cDNARDA分析

寻找小菜蛾抗溴氰菊酯品系中差异表达基因,初步分析小菜蛾敏感品系与抗溴氰菊酯品系间的遗传差异.采用改进的cDNA代表性差异分析法,以小菜蛾抗溴氰菊酯品系的cDNA为Driver扩增子、敏感品系的cDNA为Tester扩增子,通过四轮消减杂交,获得1条200bp左右的差异扩增带.将此差异扩增带克隆于pMD18-T载体,随机挑选10个克隆测序.将所得的10个序列与GenBank等数据库作同源比较,发现仅有1个序列与已知泛素基因有较高同源性,但它与小菜蛾抗药性的关系尚未查明.     

基于DNA条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定

为筛选合适的基因序列对镰刀菌属Fusarium真菌进行检测鉴定,以从不同寄主分离获得的11种57株镰刀菌为材料,选择nr DNA-ITS、EF-1α、mt SSU和β-tubulin作为候选基因,将序列获得的难易程度和种内与种间遗传距离频率分布作为评价指标,对测序获得的有效序列进行研究,筛选出该属的DNA条形码。结果表明:EF-1α基因具有较高的PCR扩增与测序成功率,为98.2%,较mt SSU和β-tubulin基因更容易获得序列片段;且种内与种间遗传距离重叠部分较少,除木贼镰刀菌F.equiseti种内遗传距离为0.029,大于黄色镰刀菌F.culmorum和禾谷镰刀菌F.graminearum种间遗传距离0.021外,种间差异明显大于种内差异,优于其它基因,能更好地区分镰刀菌;利用EF-1α基因序列构建的系统发育树显示,相同种聚集在同一分支,不同种划分在不同分支,鉴别能力较好;EF-1α基因不能扩增出其它6株非镰刀菌属的主要植物病原真菌,而对镰刀菌的PCR扩增效果很好,电泳检测结果条带单一、明亮。表明EF-1α基因可作为镰刀菌属鉴定的DNA条形码。     

小菜蛾对阿维菌素的抗性选育及交互抗性研究

用阿维菌素对小菜蛾进行室内抗性汰选,选择压为约杀死种群70％的剂量。连续施药7～8次即表现抗性趋势,汰选至11代,获得抗性指数为80.71的抗性种群(ABM-R)。ABM-R种群对所测试的有机磷杀虫剂乙酰甲胺磷、有机氯类的硫丹、沙蚕毒素类的杀螟丹、氨基甲酸酯类的灭多威、微生物杀虫剂Bt、磺胺脲类衍生物丁醚脲、芳基取代的吡咯杂环化合物虫螨腈和昆虫生长调节剂定虫隆、虫酰肼无交互抗性(R/S为0.73～1.19),而对苯基吡唑类氟虫腈的敏感性却有所上升(R/S为0.22)。增效剂试验显示,PB和唧对ABM-S种群无增效作用,而对ABM-R种群增效作用显著,增效比分别为24.57和13.61,表明多功能氧化酶和羧酸酯酶在抗性机制中可能起重要作用。     

小菜蛾重要寄生蜂——半闭弯尾姬蜂在中国的地理分布

半闭弯尾姬蜂Diadegma semiclausum是小菜蛾Plutella xylostella的一种主要寄生蜂,在气温较温和的地区可对小菜蛾种群起到明显控制作用.文献中未见该蜂在中国自然分布的记录.在北京、山东、河南、山西、宁夏、新疆等地采得的一种弯尾姬蜂与澳大利亚引进的半闭弯尾姬蜂形态特征一致.对中国北京和澳大利亚昆士兰两地的弯尾姬蜂种群进行了杂交试验,种群间正交、反交和回交的子代数和雌性比与种群内交配的无显著差异,表明这两个地理种群在生殖上完全亲和,属同种.这是首次以形态学和遗传学证据证明半闭弯尾姬蜂这一重要天敌在中国广泛分布.     

家蚕的一种微孢子虫对小菜蛾的致病力测定

测定了从家蚕体内分离的一种微孢子虫Vairimorpha sp.对小菜蛾的致病力。室内试验结果表明,当起始侵染期为小菜蛾2龄幼虫,浓度为1×10~6孢子/ml时对当代小菜蛾的致病力最高,幼虫的死亡率可达80.00％～82.67％,蛹死亡率可达50.00％～52.94％,而小菜蛾雌成虫的产卵量由对照的249.64～278.38粒/雌下降到120.56～126.72粒/雌,产卵量下降50％左右;当起始侵染期为3龄幼虫,浓度为1×10~6孢子/ml时,当代幼虫的死亡率只有40.00％～61.33％,与起始侵染期为2龄时相差很大,蛹死亡率和成虫每雌产卵量下降率与起始侵染期为2龄时差异不大。另外,家蚕微孢子虫还可通过垂直传染方式影响下代小菜蛾幼虫的死亡率。     

植物保护剂保卫德对小菜蛾种群控制作用

植物保护剂保卫德(BIOACT—D35)对小菜蛾Plutella xylostella L.种群的控制作用主要表现在对成虫产卵的忌避作用、对幼虫的拒食作用以及对生长发育的影响和减少幼虫危害力等方面。10ml/L处理对成虫产卵忌避率为81．43％，对幼虫的选择性和非选择性拒食率分别为96．32％和93．17％，幼虫总取食量是对照的67．4％，使种群趋势指数(I值)由对照的18．2840降为1．94贝，干扰作用控制指数(IIPC)为0．1066。状态空间分析法的模拟结果亦表明，主要控制作用表现在种群发展初期对成虫产卵的忌避作用。     

小菜蛾对唑虫酰胺的抗性监测、抗性生化机制及交互抗性

为了明确小菜蛾Plutella xylostella对唑虫酰胺的抗性特征,采用生物生化方法测定了江西省5个蔬菜产区小菜蛾田间种群对唑虫酰胺的抗性水平,并研究了小菜蛾唑虫酰胺抗性品系对其它药剂的交互抗性和生化抗性机制。结果显示,分宜县和高安市小菜蛾田间种群对唑虫酰胺尚未产生明显抗性,永丰县、德安县和余江县小菜蛾种群对唑虫酰胺产生了低水平的抗性,抗性倍数为5.20~8.20倍;小菜蛾唑虫酰胺抗性品系对阿维菌素、氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和茚虫威有中低水平的交互抗性,抗性倍数分别为11.72、3.44、2.77和2.20倍,而对溴虫腈、定虫隆和丁醚脲无交互抗性;增效剂磷酸三苯酯和胡椒基丁醚对小菜蛾唑虫酰胺抗性品系均有显著增效作用,增效倍数分别为3.42倍和2.64倍;唑虫酰胺抗性品系的酯酶和多功能氧化酶活性均显著提高,分别为敏感品系的2.18倍和1.64倍。研究表明,小菜蛾对唑虫酰胺产生抗性可能与酯酶和多功能氧化酶活性的升高有关。     

田间小菜蛾抗药性监测及毒理机制研究

田间监测结果表明，福州地区小菜蛾Plutella xylostella(L.)已对生产上常用的各类杀虫剂产生不同程度的抗性，从9月至次年5年期间，田间小菜蛾表现出较高水平的抗性，而在8月份则表现出明显低的抗性水平，短期高温和长期低温的环境条件可明显抑制小菜蛾幼虫的AChE和CarE活性，但短期低温的环境条件对小菜蛾幼虫的AChE和CarE活性影响不大，饲养温度的变化不会影响小菜蛾幼虫AChE和Ki值，但在较高的酶与杀虫剂的反应温度下，有机磷对小菜蛾、菜青虫和黄曲条跳甲AChE的抑制作用显著增高，此外，探讨了田间影响小菜蛾抗性水平的环境因素及毒理学机制。     

小菜蛾Toll-6基因的克隆及功能分析

为探究Toll-6基因在小菜蛾Plutella xylostella先天免疫中的功能,对克隆鉴定的Toll-6基因序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测Toll-6基因的时空表达模式及微生物侵染响应模式,体外验证其在微生物结合、病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）结合和细菌凝集等方面的功能。结果表明：Toll-6基因全长2 313 bp,编码770个氨基酸,预测Toll-6蛋白具有富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats,LRR）胞外区、跨膜区和Toll/白介素-1受体同源（Toll/interleukin-1 receptor homologous,TIR）胞内等典型Toll受体家族特征;Toll-6基因在不同发育阶段及不同组织中均有表达,其中成虫期表达量最高,4龄幼虫期次之,在4龄幼虫中肠表达量最高;此外,苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis菌株Bt8010侵染小菜蛾4龄幼虫6 h后,Toll-6基因表达被显著抑制,而黏质沙雷氏菌Serratia marcesc...     

小菜蛾三类主要化感受体基因的虫态、组织和性别表达特异性分析

为明确小菜蛾Plutella xylostella体内主要化感受体的表达分布特性,通过对特定组织转录组数据分析并结合半定量RT-PCR测定,研究小菜蛾气味受体（odorant receptor,OR）、离子型受体（ionotropic receptor,IR）和味觉受体（gustatory receptor,GR）3类化感受体基因在不同虫态、组织及性别中的表达特异性。转录组数据分析结果显示,共有48个OR、8个IR和15个GR基因在被测组织中表达,不同基因呈现不同的组织表达特异性。通过整合基因组和转录组数据分析共获得62个GR基因,其中48个为全长序列;系统进化树分析结果表明,48个全长GR中3个属于CO₂受体,10个属于糖受体,35个属于苦味受体;成虫头（去除触角后）、触角、足、翅、雌成虫产卵器及4龄幼虫头部分别表达19、22、27、21、24和21个GR基因;成虫性别间比较发现,PxylGR2、PxylGR20、PxylGR61基因在雌成虫头部中表达量较高,PxylGR5、PxylGR23、PxylGR34、PxylGR37基因在雌成虫触角中表达量较高,PxylGR37、PxylGR53、PxylGR54基因在雌成虫足中表达量较高,而PxylGR17、PxylGR21和PxylGR22基因在雄性翅中表达量较高。     

虱螨脲对小菜蛾成虫繁殖力及子代种群发展的影响

为探究虱螨脲对小菜蛾Plutella xylostella成虫的亚致死作用,通过残留药膜法或饲喂法使用50 mg/L虱螨脲对小菜蛾成虫进行处理,分别测定小菜蛾成虫繁殖力、寿命和卵孵化率,通过建立小菜蛾成虫子代生命表确定虱螨脲处理成虫对其后代的影响。结果表明,残留药膜法处理后,小菜蛾成虫单雌产卵量和卵孵化率分别比对照显著降低39.09粒和19.38个百分点;饲喂法处理后,小菜蛾成虫单雌产卵量、雌成虫寿命和卵孵化率分别比对照减少13.42粒、1.56 d和72.03个百分点,卵孵化率与对照差异显著。虱螨脲处理后,小菜蛾成虫子代1龄幼虫存活率、雌成虫寿命、F_1代单雌产卵量和F_1代卵孵化率分别为74.29%、5.90 d、146.65粒和84.43%,均显著低于对照,种群趋势指数降低,表明对子代种群发展有一定的干扰作用。此外,虱螨脲处理小菜蛾雌、雄虫对其产卵量无影响,但处理雌虫显著降低卵孵化率,处理雄虫对卵孵化率无明显影响,说明虱螨脲作用于小菜蛾成虫,仅对卵子形成及受精卵的胚胎发育过程产生影响,而对精子的生成及转移无影响。表明虱螨脲可通过成虫取食或接触而控制小菜蛾种群发展。