水貂和狐犬瘟热病毒F基因的克隆与序列分析

为探寻免疫失败的原因,对山东某养殖场免疫后的发病水貂和狐犬瘟热组织病料分别提取RNA进行RT-PCR扩增。将PCR得到的部分F基因克隆到pMD18-T载体上测序,并与疫苗株ND进行序列分析。结果表明,水貂和狐的CDV与OND的核苷酸同源性为98.6%9、8.6%,氨基酸同源性为98.0%9、8.0%。水貂和狐两者核苷酸同源性为98.0%,氨基酸同源性为95.9%。     

核酸探针检测犬瘟热病毒方法的建立和初步应用

根据犬瘟热病毒（CDV）基因序列的结构特点,在其编码核衣壳蛋白的高度保守基因区内,设计合成一对特异性引物.以RT-PCR技术从CDV基因中扩增出了一段长度为430 bp的核苷酸cDNA,并制备出地高辛标记的CDV核酸探针.特异性检测结果表明,该探针能与CDV标准株和地方分离株核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、MV等病毒的核酸杂交反应均为阴性.敏感性检测结果表明,该探针对CDV的检出量可达到0.1 pg.用所制备的核酸探针对某宠物诊所疑似犬瘟热病例进行临床诊断初步应用试验,表明该标记探针完全可用于CDV的临床检测.     

Detection of intracellular canine distemper virus antigen in mink inoculated with an attenuated or a virulent strain of canine distemper virus

Using an indirect immunofluorescence technique, the distribution of viral antigen in various tissues and blood mononuclear leukocytes was studied in wild mink, either vaccinated with an attenuated vaccine strain of canine distemper virus (CDV) or experimentally inoculated with the virulent Snyder-Hill strain of CDV. Viral antigen was detected in cells of the lymphoid system 6 to 12 days after vaccination. From 2 to 3 days after inoculation with the virulent strain, CDV antigen was demonstrated in cells of the lymphoid system and, during the incubation period, the antigen had spread to the epithelia and brain at days 6 and 12, respectively. In clinical cases of acute fatal canine distemper, the viral antigen was detected in a wide variety of tissues, including the cells of the lymphoid system, epithelial cells of skin, mucous membranes, lung, kidney, and cells of the CNS. The diagnostic importance of CDV antigen detection is discussed on the basis of these findings.     

非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达

为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%～97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

Comparison of the Immunofluorescence Assay with RT-PCR and Nested PCR in the Diagnosis of Canine Distemper

Two pairs of primers were prepared, both localized within the sequences of the nucleoprotein gene (NP) of canine distemper virus (CDV). A number of experiments were done to optimize the conditions of RT-PCR and nested PCR methods. The nucleic acids of the Onderstepoort, Rockborn, Snyder Hill and Lederle strains of CDV could be detected with these primers. However, they did not react with the sequences of the Edmonston strain of the measles virus. The detection limit for RT-PCR was 10 TCID50 and for nested PCR 0.1 TCID50 of CDV. The RT-PCR was able to demonstrate the nucleic acid of CDV in the blood of all seven puppies vaccinated with a modified live virus. Blood samples of 23 dogs clinically suspected of distemper were examined by RT-PCR combined with nested PCR, and the results were compared with the detection of the CDV antigen in the smears from the mucous membranes by the direct immunofluorescence (IF) test. Of the 23 dogs, 12 were positive in nested PCR, six in the IF assay, and only two in single RT-PCR. It is concluded that nested PCR seems to be the most sensitive method for ante-mortem diagnosis of canine distemper, especially in its subacute or chronic forms.     

RT-PCR方法检测犬瘟热的流行情况

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬科烈性传染病,给患病动物带来重大危害。本研究基于犬瘟热病毒的NP蛋白基因设计特异性引物,利用RT-PCR获得287 bp目的片段,经TA克隆并测序。结果表明,该片段与NCBI上公布的犬瘟热病毒NP序列(登录号:EU716322)同源性达到98%。利用该特异性的RT-PCR方法,检测杭州市及周边部分地区犬瘟热的流行情况,结果表明,整个杭州及周边地区犬瘟热病毒总阳性检出率为6.7%,杭州城区阳性个体数最多,阳性率最高达到18.8%,其他地方(临安、台州、舟山)阳性率较低。该研究为犬瘟热的综合防制提供基础数据。     

一株水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定

为寻找免疫失败的原因,有效防治犬瘟热的流行,对临床一水貂犬瘟热疑似病例,取其肝、脾、脑等组织研磨后接种Vero和BHK细胞分离病毒,并对分离毒株进行一系列鉴定。通过电镜观察,发现了大小约150 nm的副黏病毒样粒子。结果表明,分离株对鹅、鸡、小鼠、家兔、山羊、猪红细胞均无凝集性,该分离株的毒价TCID50为10-4.87;分离株病毒对乙醚、氯仿敏感,病毒的核酸型为RNA。经间接免疫荧光试验,接种病毒的BHK细胞出现特异性的亮绿色荧光。对分离株和对照毒株分别提取RNA进行RT-PCR扩增,最后得到与预期扩增片段(294 bp)相符的核酸电泳带,充分证明分离病毒为犬瘟热病毒。     

水貂犬瘟热病毒分离鉴定及其H基因序列分析

为了解山东地区水貂犬瘟热病毒(CDV)遗传变异特征,采集水貂养殖场的发病水貂病料,通过RT-PCR鉴定为CDV阳性,将阳性病料接种Vero/Dog SLAM细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光、电镜负染、测序等方法鉴定,得到4株犬瘟热病毒,分别命名为WD1株、WD2株、WX1株和WX2株。分离株H基因测序结果显示,WD1株、WD2株、WX1株均为Asia-Ⅰ型,其中WD1和WD2与近几年仅在水貂和狐狸养殖场流行的新犬瘟热毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.5%~99.2%和97%~99%;WX-1型与国内犬源HL001株的同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.6%和99.5%;WX2与疫苗株同属于一个分支,与疫苗毒Lederle株核苷酸和氨基酸序列同源性高达99.5%和98.8%。结果表明,水貂养殖场存在多株犬瘟热病毒混合感染的情况,提醒养殖场应注意防控,该结果也为犬瘟热病毒分子流行病学积累了资料。     

Immunohistochemical demonstration of the putative canine distemper virus receptor CD150 in dogs with and without distemper

Signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) or CD150 can function as a receptor for the canine distemper virus (CDV) in vitro. The expression of SLAM was studied using immunohistochemistry in order to evaluate the presence and distribution of the receptor in dogs in vivo. Additionally, receptor expression was assessed after experimental infection of dogs with CDV. In 7 control dogs without distemper virus, the receptor was found in various tissues, mostly on cells morphologically identified as lymphocytes and macrophages. In 7 dogs with early distemper lesions characterized by presence of the virus, higher numbers of SLAM-expressing cells were found in multiple tissues recognized as targets of CDV compared with those in control dogs. These findings suggest that SLAM, a putative distemper receptor, is expressed in dogs in vivo. Additionally, virus infection is associated with up-regulation of SLAM, potentially causing an amplification of virus in the host.     

犬瘟热病毒h基因克隆测序与原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒h基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出犬瘟热病毒弱毒疫苗株的h基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经蓝白斑筛选及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定挑出阳性克隆进行序列测定,序列分析结果表明,该基因与GenBank上标准代表毒株序列完全同源;与扬州分离株、长春分离株、新疆分离株、日本分离株D85755同源性分别为90.6%、91.3%、90.5%、91%;与Onderstepoort、Convac株、美国分离株98-2666-2同源性较高,分别为97.7%、97.2%、98.1%。再将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,转化感受态E.coli BL21细胞,经IPTG诱导表达分子质量约64 ku的重组H蛋白。     

急性犬瘟热感染组织脏器的研究

临床中犬瘟热多分为急性和亚急性,3月龄犬多发本病,急性病例和亚急性病例的临床症状和病毒复制的脏器与慢性病例有很大区别。临床上急性病例的病变主要集中在肺脏和淋巴组织,组织病理学可观察到淋巴结炎和多核巨细胞性肺炎。根据免疫组织化学染色结果发现,在犬瘟热急性病例的淋巴结皮质中犬瘟热抗原呈强阳性,且密度很高。而病犬虽然表现出严重的肺炎症状,但在犬的肺脏中犬瘟热病毒抗原阳性反应弱,仅在支气管上皮和少量的巨噬细胞胞浆中观察到。犬瘟热病毒首先在犬的淋巴组织中进行复制、增殖,破坏被膜下淋巴窦和淋巴小节中的T淋巴细胞和B淋巴细胞,影响淋巴组织输出到外周血液循环中的淋巴细胞数量。本研究结果表明,犬瘟热虽然临床上以肺脏病变最严重,但在急性和亚急性病例,犬瘟热病毒主要在淋巴组织的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞中增殖,故应以淋巴组织作为犬瘟热病毒的主要分离脏器。     

贵州犬瘟热病毒的分离鉴定

对流行病学调查、临床症状检查和ELISA检测为犬瘟热阳性的自然发病犬,取肠内容物为病料,采用同步培养方法接种于犬肾细胞系(MDCK)进行病毒的分离,并对分离株进行了形态学特征、血凝特性、动物感染及RT-PCR鉴定。结果表明:病料接种MDCK细胞产生明显的细胞病变(CPE),电镜负染观察接毒细胞培养物见有典型的犬瘟热病毒粒子。分离株不凝集鸡及人“O”型红细胞,接种犬出现明显的临床症状和病理变化。用RT-PCR技术检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长为760 bp,与预期设计的长度相同,由此确证分离株为犬瘟热病毒,命名为CDV-GZ2株。     

犬瘟热病毒上海分离株M蛋白编码基因的克隆与序列分析

本研究以犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)上海分离株的总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV M蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,RT PCR扩增M蛋白基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV上海分离株M蛋白基因序列与CDV A75/17 株、Onderstepoort疫苗株等其它7株的同源性在95%以上;编码氨基酸的同源性也高于97%。推测M蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白。     

犬实验感染CDV的病理学研究

对实验感染犬瘟热病毒的病犬进行了系统的病理学观察,并用酶标ＳＰＡ法对病犬脏器组织中ＣＤＶ抗原进行了定位检查。结果表明,淋巴系统各器官组织是ＣＤＶ急性感染早期首先侵犯的靶器官。脏器组织的病理改变与ＣＤＶ抗原检出呈正相关。脏器组织中包涵体的检出与形态结构具有一定的特征性和示病意义,但采用免疫组化方法检查ＣＤＶ抗原,更具优越性。作者认为,ＣＤＶ９３０３９株和ＣＤＶ９３０４１株是致病力很强的泛嗜性ＣＤＶ。     

用半套式PCR检测犬瘟热病毒的研究

根据ＧｅｎＢａｎＫ中Ｂａｒｒｅｔｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的附着或血凝蛋白基因序列,设计合成了能扩增７６０ｂｐ基因片段的半套式引物。用异硫氰酸胍－－酚－－仿一步抽取法提取细胞总ＲＡＮ进行反转录,再以此产物进行半套式ＰＣＲ扩增,并筛选出最佳ＰＣＲ扩增。结果经半套式ＰＣＲ扩增能得到与设计片段大小相同的产物,并且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验     

小熊猫犬瘟热病毒感染的诊断

对某动物园发病死亡小熊猫的病料进行电镜检查 ,发现了犬瘟热病毒 ( CDV)样病毒粒子 ;病料用 RT-PCR检测 ,均为 CDV阳性 ,并从部分病料中分离出了 CDV,说明小熊猫存在 CDV感染。用从小熊猫肝脏病料中分离的 CDV LP株接于幼犬 ,结果所有接种犬均发生了犬瘟热。中和试验结果表明 ,LP株是一免疫原性强的 CDV株。     

犬瘟热病毒贵州分离株H基因的克隆及其序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒Onderstepoort株序列设计特异性引物,以犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)RNA为模板,应用RT-PCR对病毒H蛋白编码基因进行了扩增、克隆及序列分析.测序结果表明,CDV-GZ1 H基因ORF由1 824 bp组成,可编码607个氨基酸;与已发表23株其它CDV H基因核苷...     

小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析

本研究对军事兽医研究所病毒二室分离驯化后的小熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因组进行全序列测定,并对其基因组特征及H基因遗传稳定性进行比较分析。根据GenBank公布的犬瘟热病毒全长基因组序列设计合成17对特异性引物,以小熊猫源犬瘟热病毒总RNA为模板,RT-PCR进行分段扩增,并克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经测序、拼接获得全长cDNA序列。结果显示,小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列与GenBank登录号分别为AF014953、AY445077、AY542312、AY466011、AY386316、AF164967、EU716337、EU726268、AY443350、AB474397、GU138403和AY649446的12个不同毒株全基因序列的同源性分别为86.6%、92.4%、92.5%、92.5%、94.3%、96.3%、95.9%、87.1%、94.5%、92.3%、87.4%和94.6%,与标准强毒株A75/17株(AF164967)的亲缘关系最近,全基因同源性达96.3%,但与疫苗株Onderstepoort(AF014953)亲缘关系相对较远,同源性为86.6%。小熊猫源犬瘟热病毒H基因与其他不同地区具有代表性的30株CDV进化树分析显示,小熊猫源犬瘟热病毒属于Asia Ⅰ型,H蛋白中309－311位氨基酸残基所形成的潜在糖基化位点,为疫苗株没有而野毒株所共有的,并且可能与病毒的免疫原性有关。因此,致弱的小熊猫源CDV在预防免疫的针对性上可能强于已有的疫苗株。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒融合蛋白F基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,扩增大小为337bp的目的片段,建立犬瘟热病毒F基因的RT-PCR检测方法。结果表明,该方法具有很强的特异性和很高的敏感性,可作为犬瘟热临床快速诊断的一种方法。