家畜胚胎体外生产技术

家畜胚胎体外生产技术是胚胎工程技术的重要内容之一。本文对家畜胚胎体外生产的相关主要技术环节,包括卵母细胞的体外成熟技术、体外受精技术及早期胚胎的体外培养技术等进行了综述,同时对该技术的发展前景进行了展望。     

猪体外胚胎生产的研究进展

与牛羊等动物的体外胚胎生产（in vitro production，IVP）技术相比，猪IVP技术尚不成熟。猪IVP主要存在卵母细胞的细胞质成熟差、多精子受精率高和胚胎质量差的问题，这严重制约了该繁殖生物技术在转基因猪生物反应器领域的应用。笔者在查阅近10年的国内、外相关研究后，从如何优化猪卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation，IVM）、体外受精（in vitro fertilization，IVF）和胚胎的体外培养（in vitro culture，IVC）3个方面进行了探讨。     

牛胚胎体外生产技术概要

胚胎体外生产也称体外受精技术,是继人工授精、胚胎移植技术之后,家畜繁殖领域的第三次革命。牛胚胎体外生产包括卵子的成熟培养、精子获能、体外受精和胚胎早期培养等4个连续过程。自1982年以来,家畜体外受精技术,尤其是牛体外受精技术的发展十分迅速,仅仅10年时间,就已从理论     

影响猪卵母细胞体外成熟的一些物理性因素

对猪的研究是生物新技术中新的热点和经济增长点，猪的体外成熟是体外受精、性别控制、克隆及转基因等许多新技术成功与否的前提和关键，有许多物理方面的因素影响到猪的体外成熟。     

水牛胚胎体外生产研究综述

近年来采用其它家畜上的程序来进行水牛体外胚胎生产(invitroproduction,IVP)引起了越来越多的关注。水牛胚胎体外生产已获得了较高的卵母细胞成熟率、受精率和卵裂率,但囊胚发育率和体外胚的移植成功率仍较低,水牛IVP胚胎体外生产效率比黄牛低得多。在IVP技术应用于水牛生产育种之前,还有一些问题必须解决。笔者对水牛胚胎体外生产的不同技术,包括未成熟卵母细胞的体外培养成熟和受精以及胚胎体外培养卵裂发育至囊胚等进行综述。还讨论了胚胎体外生产存在的问题及可能的解决方案。     

猪体外成熟,受精卵的体外培养研究

用自己改良的发育培养基使３．９％￣２０．１％体外成熟体外受精卵在体外发育过了４－细胞阻滞期，到达８￣１６－细胞期，个别发育到桑椹期；培养中还观察到葡萄糖对猪胚胎的体外发育没有抑制作用，说明葡萄糖不是猪胚胎体外培养中出现阻滞的原因，在培养基中添加ｐＦＦ可促进猪胚胎体外发育，使发育至８￣１６－细胞期的胚胎率从３．９％，提高到１０２．２％。     

猪囊胚的体外生产技术

利用屠宰场猪卵巢卵母细胞经体外成熟、体外受精后,体外培育至囊胚阶段,并以体外生产的猪囊胚细胞数来衡量囊胚质量.试验共对5 84 9枚猪卵母细胞进行体外成熟、体外受精,其中3974枚卵母细胞在体外受精后发生卵裂,卵裂率为6 6 4 %±1 6 % ,2 136枚发育形成囊胚,占卵裂胚数的5 6 2 %±2 4 % ,占卵母细胞数的36 7%±1 3% ;检查了98枚囊胚,其平均细胞数为4 1 6±1 8;另外又检查了4 7枚囊胚,其平均内细胞团细胞数为3 85±0 5 6、滋养层细胞数为4 4 70±2 87.     

牛卵母细胞体外成熟及体外受精的研究

本研究分析了卵巢不同性周期阶段（卵泡期、黄体期）、外源激素（ＦＳＨ、ＬＨ、雌激素）和不同卵泡液浓度（１０％,２０％,３０％）对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,卵巢的不同性周期阶段对卵母细胞体外成熟的影响不大（６３９％和５８７％）;成熟培养基中添加ＦＳＨ（１０ｍｇ／Ｌ）,ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）和同时添加ＬＨ、雌二醇（１ｍｇ／Ｌ）,可以促进卵母细胞的体外成熟,成熟率分别为６３０％,６４０％,６９１％;卵泡液（１０％,２０％,３０％）代替血清,其成熟率分别为５０７％,５７６％,５１９％,２０％ｂＦＦ效果最好。本研究对精子的两种处理方法进行了比较,发现在相同精子密度条件下（１×１０６～２×１０６个／ｍＬ）,Ｐｅｒｃｏｌ液处理精子的受精率（４７１％）显著低于上浮法处理精子的受精率（５７１％）（Ｐ＜００５）。     

奶牛体外受精相关影响因素分析

[目的]探讨和研究奶牛体外受精（IVF）各技术环节中一些因素,对奶牛IVF整个过程的影响。[方法]研究不同来源的卵母细胞、精液的不同处理方法、不同的培养体系,不同受精时间,受精密度对奶牛IVF的影响。[结果]屠宰场采集的卵母细胞和活体采卵收集的卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率差异不显著;对精子分别采用percoll梯度密度离心和上浮法处理,两组的卵裂率囊胚发育率无明显差异,用SOF液和BO液体外培养,两培养体系的卵裂率和囊胚发育率均差异不显著;受精时间为8、10 h及10、12 h的囊胚发育率均差异不显著,但受精8 h的囊胚发育率显著高于受精时间12 h;受精微滴（100μl）中放置成熟的卵母细胞数（20、40个）,两组的卵裂率和囊胚发育率均下降,且差异显著。[结论]随受精时间的延长,卵裂率和囊胚发育率逐渐降低,差异不显著,但受精8 h的囊胚发育率显著高于受精12 h;受精微滴（100μl）中放置20个成熟的卵母细胞,可取得较好的体外受精效果。     

体外生产猪原核期胚胎的初探

初步研究了在体外生产猪的原核期胚胎.结果表明:将在体外成熟培养44h的卵母细胞移植入发情当日的母猪体内,同时进行人工授精,受精后16 h冲出胚胎,获得同期原核期胚胎的效率最高,可以降低多精入卵的发生率.     

中草药对奶牛乳房炎病原菌的体外抑菌作用

[目的]寻找治疗奶牛乳房炎的新途径。[方法]选择常用7味中草药煎剂及5种复方制剂,采用试管二倍稀释法,对从患隐性乳房炎奶牛的乳汁中所分离的5种致病菌进行抑菌试验,并测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。[结果]结果表明:野菊花、黄连、大青叶、复方Ⅰ及复方Ⅴ对这5种病原菌均具有较强的体外抗菌活性。[结论]该研究为研制防治奶牛乳腺炎中草药制剂的科学组方提供了理论依据。     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞体外发育能力的影响

采用猪未成熟(GV期)和体外成熟(MⅡ期)卵母细胞分组进行冷冻保护剂毒性试验,试验组经冷冻液处理,对照组不用冷冻液处理。结果表明,GV期与MⅡ期卵母细胞相比,两者经冷冻保护剂处理后,其存活率、体外受精胚卵裂率均无显著差异(P>0.05);试验组GV期卵母细胞存活率、体外成熟率及体外受精胚卵裂率虽略低于对照组(85.9%,72.4%和50.9%对91.3%,73.9%和53.3%),但差异不显著(P>0.05);试验组MⅡ期卵母细胞存活率虽显著低于对照组,但卵裂率与对照组无显著差异(P>0.05)。表明所用冷冻液及其处理程序,对卵母细胞无明显毒性。分3组对猪卵母细胞进行冷冻保存试验:I组为对照组;II组为GV期卵母细胞冷冻组;III组为MⅡ期卵母细胞冷冻组。结果表明,经开放式拉管(Open pulled straw,OPS)法玻璃化冷冻后,GV期和MⅡ期卵母细胞均获得较高的形态正常率,但GV期卵母细胞冷冻后存活率要显著高于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。经玻璃化冷冻后,GV期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均明显低于新鲜卵母细胞(42.6%和7.79%对73.9%和53.3%,P<0.05),MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后未获得卵裂。在GV期卵母细胞冷冻组,154枚卵母细胞冷冻后经体外成熟、体外受精及体外培养,共有12枚发生卵裂,其中6枚发育至8-细胞,3枚发育至16-细胞,3枚发育至桑椹胚。本研究表明,所用冷冻方案更适合于猪GV期卵母细胞的冷冻保存。     

犬辅助生殖技术研究进展

综述了犬卵母细胞体外培养、精液保存和人工授精、体外受精、胚胎移植等犬的辅助生殖技术,探讨了犬辅助生殖技术的研究现状和应用前景。     

日本占领时期的台湾乳畜饲养与乳品生产

台湾近代开埠通商之前,本地居民（包括原住民及从大陆来的移民）基本没有饮食奶制品的习俗。1860年《天津条约》签订后,台湾北部的淡水、鸡笼（今基隆）成为通商贸易港。台北、基隆、淡水等地,开始少量饲养本土黄牛来挤奶,提供给来台西洋人饮用。1895年,来台从事家畜养殖的日本人,陆续引进西洋奶牛,进行具有近代畜牧场性质的奶牛规模化饲养。日本统治当局成立了专门的畜牧科研机构,用引进的奶牛与本地黄牛进行杂交选育,先后培育出多个适合台湾饲养的奶牛品种。1943年为战前台湾的奶牛饲养高峰,当年存栏奶牛1777头,年产牛奶2300吨。     

序贯共培养体系对小鼠体外受精胚胎发育效果的影响

采用体外分离培养的兔输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞构建了序贯共培养体系,并与体外受精得到的受精卵进行共培养。试验结果表明,HTF液受精率显著高于T6液(P<0.05),更适用于卵母细胞的体外受精。序贯共培养体系和输卵管上皮细胞培养组2-细胞率都显著高于单独培养液组和子宫内膜细胞培养组(P<0.05),二者均可克服2-细胞阻滞。序贯共培养体系胚胎的囊胚体外发育率显著高于其他共培养组(P<0.05)。表明序贯共培养体系比单一体细胞共培养体系能更好地模拟体内环境,提高早期胚胎的体外发育率。     

猪体外受精胚胎、孤雌激活胚胎以及体细胞核移植胚胎的体外培养

【目的】本研究系统比较了体外受精胚（IVFEs）、孤雌激活胚（PAEs）以及体细胞核移植胚（NTEs）的发育率和囊胚质量，同时还比较了PZM-3和NCSU-23两种培养基培养对PAEs以及NTEs发育的影响。【方法】利用体细胞核移植技术、体外受精技术和孤雌激活技术分别生产猪的NTEs、IVFEs和PAEs，开展体外培养。【结果】（1）IVFEs、 PAEs 和NTEs的卵裂率分别为72.0％，66.0％和63.5％，各组间没有显著差异(P>0.05)；囊胚形成率分别为11.0％，22.6％和16.9％，也不存在明显不同(P>0.05)；然而，在囊胚质量，即ICM细胞数/总细胞数的比例上， IVFEs和NTEs均优于PAEs（0.448％，0.356％ vs 0.122％，P<0.05）。（2）对PAEs来讲，以PZM-3为基础培养基时囊胚率明显高于以NCSU-23为基础培养基时的处理组（35.4％ vs. 22.6％，P<0.05）；而对NTEs而言， 两种培养基在支持胚胎形成囊胚方面的效果相当（26.6％ vs. 21.1％，P>0.05），虽然PZM-3培养时胚胎卵裂率显著低于NCSU-23培养组（47.5％ vs. 63.5％，P<0.05）。【结论】（1）PAEs的囊胚质量在3种来源的胚胎中最差；（2）对PAEs理想的培养基，当用于NTEs培养时却不一定是最佳的选择。     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。