昆明小鼠ES细胞的分离培养及鉴定

[目的]摸索一种适合昆明小鼠ES细胞分离培养的方法,以提高昆明小鼠ES细胞的建系率。[方法]分别采用5种方法分离ICM和ES细胞集落,摸索了以BMSCs作为饲养层时,丝裂酶素处理的合适时间。[结果]连续消化法要明显好于其他4种方法。MMC处理BMSCs 1、1.5、2 h时效果较好,3个时间点无显著差异(P>0.05)。mMEF作为饲养层与BMSCs作为饲养层时获得5代ES细胞相比差异不显著(P>0.05)。[结论]连续消化法分离ES细胞效率较高,饲养层采用MMC处理1~2 h的BMSCs饲养层或常规mMEF饲养层对昆白小鼠ES细胞无明显影响。     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后9．5－13．5d小鼠胎儿生殖峭／腺或其类似物及周围组织，采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞（EG细胞）系。即具有连续传代的能力（1例来自交配后11．5d胎儿类ES细胞传至10代），部分细胞集落呈典型鸟巢状结构，AP染色呈阳性，体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后7．5－8．5d和14．5－15．5d的小鼠胎儿，原代观察到类ES细胞集落，继代培养未观察到类ES细胞集落，16．5－18．5d小鼠胎儿原代培养未观察到ES样细胞集落。     

大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的效果

采用大鼠心肌条件培养基对昆明白小鼠胚胎干细胞进行分离、消化传代、培养鉴定等,研究大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的作用效果。结果显示,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠3.5d囊胚胚胎干细胞集落分离中,所分离的昆明白小鼠胚胎干细胞集落具有岛屿状生长,隆起于饲养层上;碱性磷酸酶染色为强阳性;体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;经过常规冻存传代的胚胎干细胞集落具有较为一致的生长形态,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;对传至第5代的小鼠胚胎干细胞集落进行核型分析,小鼠胚胎干细胞核型正常率大于75%。试验证实,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养过程中效果较好。     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到 ES样细胞集落     

小鼠卵母细胞的孤雌激活与ES细胞样集落分离

对小鼠卵母细胞进行孤雌激活用于单性生殖研究。取成年昆明白小鼠进行超数排卵,乙醇激活,同小鼠输卵管上皮细胞共培养并添加mM16培养基培养至早期囊胚阶段,移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,换成ES细胞培养液继续培养,分离消化ICM,重新接种,对分离出的ES样细胞集落进行分离培养鉴定。结果显示,小鼠卵母细胞激活率为96.99%,2-细胞发育率为93.17%,桑椹胚发育率为80.33%,囊胚发育率为73.22%。小鼠孤雌激活囊胚中分离的ES样细胞集落具有一系列ES细胞所特有的特征,如呈现出岛屿状形态,碱性磷酸酶染色为阳性,体外能够自发分化成上皮样或单个散在分布的细胞等。试验证明,小鼠孤雌胚中可以分离出ES细胞样集落。     

ES小鼠与正常小鼠血液理化指标比较研究

[目的]比较ES小鼠和正常小鼠的血液理化指标。[方法]以成年ES克隆小鼠为研究对象,测定其血液生理生化指标,与正常小鼠进行比较。[结果]ES小鼠血液中WBC、MCV、MCH、LYMPH、MONO、BASO、RDW-CV等生理指标与TP、LDL、GLU、AMY等生化指标,与正常小鼠存在显著或者极显著差异。[结论]该研究可为小鼠的基因克隆奠定基础。     

BRL-CM在昆白小鼠胚胎干细胞分离培养中的应用

目的:探讨Buffalo大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)在昆白小鼠胚胎干细胞(ES)分离培养中的应用。方法:用BRL-CM培养生长在STO(一种小鼠成纤维细胞)饲养层上的昆白小鼠的桑椹胚和囊胚,然后由囊胚内细胞团(ICM)得到ES细胞集落,在有饲养层和无饲养层时用BRL-CM培养分离得到的ES集落。结果:桑椹胚在上述培养条件下能发育成囊胚,然后囊胚在饲养层上长出ICM;用0.1%Trypsin-0.016%EDTA离散ICM,接种到饲养层上培养得到ES集落,ES集落能维持早期传代。结论:在分离培养昆白小鼠的ES细胞时,BRL-CM结合STO饲养层可以用来培养桑椹胚和囊胚,桑椹胚可以发育为囊胚并孵出内细胞团;同时,这种培养条件也能维持昆白小鼠ES细胞的增殖和早期传代。     

牛与小鼠胚胎在分化抑制培养系统中的行为比较

在自制培养基中，以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲层，观察比较了牛与小鼠胚胎在体外分化抑制培养体系中的生长行为，结果表明，牛囊胚一般培养36－60h后孵化脱带，96－120h后贴壁，120－144h为ICM传代的最佳时刻，小鼠囊胚 般培养12－24h孵化脱带，24－48h贴壁，72－96h为传的最佳时刻牛胚胎贴附于饲养层上生长，极易从饲养层上剥离，小鼠胚胎镶嵌在饲养层中，滋养层细胞与饲养层细胞间连接紧密，牛ICM色深发黑，集落隆起程度较低，小鼠ICM呈暗黄色，有呈柱状增殖的趋势，牛滋养层呈网状，小鼠滋养层为较致密的单层薄膜。     

鲤鱼上皮细胞在不同培养条件下的生长状况及与哺乳动物细胞的比较

[目的]比较鲤鱼上皮细胞在不同培养条件下的生长状况。[方法]对不同培养基、温度、胰蛋白酶浓度、CO2培养条件下鲤鱼上皮细胞（EPC）的生长状况进行观察并进行指标测定。[结果]EPC细胞在培养基M199、温度20～25℃、胰蛋白酶浓度0.05%～0.10%条件下生长较好,对CO2的需求不大。[结论]该研究结果可为鲤鱼上皮细胞最优培养条件的筛选提供依据。     

小鼠ES细胞在不同饲养层上培养nanog基因的 表达水平与生长行为

观察小鼠ES-D3细胞在MEF、新生牛睾丸支持细胞(nBTSCs)和新生兔睾丸支持细胞(nRTSCs)饲养层上生长4dnanog基因的表达水平和生长行为。RT-PCR分析显示,MEF饲养层上培养4d的ES-D3nanog基因含量高;nBTSC饲养层上培养nanog基因表达较低;而RTSC饲养层上培养nanog基因表达最低。结果显示:不同饲养层上的ES-D3细胞集落形态和培养4d分化程度有差异。在MEF饲养层上的ES-D3细胞培养4d,集落形态仍然很规则,细胞间紧密,集落表面少见大细胞,AKP染色强阳性。在nBTSC饲养层上的ES-D3细胞,集落界限清晰,AKP染色显示,集落大部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为弱阳性,可见集落表面分散有较多的大细胞。在nRTSC饲养层上的饲养层上的ES-D3,集落隆起不明显,集落界限不清晰,大部分集落形态不太规则,AKP染色显示集落中部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为全阴性,集落表面有较少的大细胞,集落周围有伸出的成纤维细胞。     

LIF和IGF-1对牛胚胎干细胞分离的影响

比较了添加 L IF,IGF- 1和 L IF+IGF对牛胚胎干细胞 (ES)分离的影响。结果表明 :1添加10 ng/m L L IF能提高胚胎贴壁率 ,促进内细胞团 (ICM)和 ES细胞的增殖并抑制其分化 ;2添加 10 ng/m L IGF- 1既能提高胚胎贴壁率 ,又能使 ICM明显增殖的时间和传代后集落出现的时间提前 ;3添加 10 ng/m L L IF+10 ng/m L IGF- 1,可以同时发挥两种生长因子的作用效果 ,更有利于牛胚胎干细胞的分离。     

胚胎干细胞的分离克隆

从全能性或多能性细胞获取、分化抑制物选择、培养基、分离方法、鉴定、保存等６个方面，对胚胎干细胞的分离培养体系的建立进行了系统综述。     

猪白血病抑制因子的真核表达与活性分析

采用分子克隆技术构建猪白血病抑制因子（LIF）的真核表达载体,表达重组猪LIF蛋白并分析其活性。酶切和DNA测序显示,所构建的真核表达质粒pcDNA3．1-pLIF—MycHis含有编码分泌型猪LIF蛋白的CD—NA序列;免疫印迹分析显示,分泌到上清中的重组蛋白在相对分子质量约37000的位置上有明显的增强表达条带;活性分析结果显示,重组蛋白能够维持小鼠E-14胚胎干细胞在未分化状态。该结果显示重组猪UF蛋白在CHO细胞中进行了正确表达并具有很好的生物活性,能够用来培养小鼠胚胎干细胞,为用于猪胚胎干细胞系的研究奠定了良好的基础。     

不同培养系统和传代方法对昆明白小鼠原始生殖细胞分离培养的影响

[目的]寻求适合昆明白小鼠EG细胞的培养系统和传代方法。[方法]常规方法从昆明白小鼠原始生殖细胞中分离EG细胞,用不同培养系统(EG细胞基础培养液,RH-CM,EG细胞基础培养液+MEF)及不同传代方法(机械法,酶消化法,连同饲养层消化法),研究对昆明白小鼠EG细胞分离克隆的影响。[结果]以RH-CM作为培养基效果最好,RH-CM能够更好地促进EG细胞贴壁增殖和集落的形成,有效地维持EG细胞未分化状态;酶消化法和连同饲养层消化法均能获得较高的克隆形成率。[结论]RH-CM和连同饲养层消化法可分别作为昆明白小鼠EG细胞的培养系统和传代方法。     

哺乳动物胚胎干细胞的研究历史和现状

与胚胎细胞相比 ,胚胎干细胞占有数量优势 ,与体细胞相比 ,则有低分化的优势。本研究在综述哺乳动物胚胎干细胞研究历史的基础上 ,概述了胚胎干细胞的分离方法和存在的问题。