H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a（＋）-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B（DE3）中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

不同外植体对草莓病毒脱除效果及病毒的多重RT-PCR检测

以草莓茎尖和花药为外植体,多重RT-PCR为检测方法研究了不同培养材料对3种草莓病毒,即斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、轻型黄边病毒(strawberry mild-yellow edge virus,SMYEV)和镶脉病毒(strawberry vein-band virus,SVBV)的脱除情况。结果表明,花药愈伤组织再生苗途径对3种病毒的脱除率为100%。而不同大小茎尖脱除病毒效果不同:0.2mm茎尖可完全脱除3种病毒,但成苗率低;0.5mm茎尖可有效脱除SMoV和SVBV,但对SMYEV脱除不彻底;0.5mm茎尖成苗率明显高于0.2mm茎尖,但较难脱除SMYEV。综合病毒脱除率和成苗率,对花药再生频率较高的草莓基因型(如红颊)可以采用花药愈伤组织再生途径进行病毒脱除,而对于花药再生困难的基因型可以考虑选用茎尖分生组织途径获取脱毒苗。     

肉鸡H9N2亚型禽流感病毒全基因测序及遗传进化分析

根据GenBank登陆的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的全基因序列,设计11对引物,运用RT-PCR方法扩增A／Chicken／Zhejiang／HJ／2007(H9N2)毒株8个基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。基因序列比较及遗传进化分析结果表明,所克隆的8个基因片段均有HJ毒株完整的开放阅读框（ORF）,其血凝素（HA）基因蛋白裂解位点的氨基酸组成为-PSKSSR*G-,为不连续的碱性氨基酸,符合低致病性AIV HA基因裂解位点的序列特征;与QA/HK/G1/97的进化关系较近,处在同一分支。其神经氨酸酶（NA）基因在63、64、65位点上有3个氨基酸（T、E、I）缺失,在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94（DK/HK/Y280/97）群系。核蛋白（NP）基因整合有同地分离的H5N1亚型流感病毒NP基因片段,进化关系较近。基质蛋白（M）基因与1999年香港感染儿童的两株流感病毒（HK/1073/99和HK/1074/99）进化关系属于同一分支。非结构蛋白（NS）基因与近年来分离的猪源H9N2亚型流感病毒进化关系相近,和1998年首次报道的猪源H9N2亚型流感病毒（SW/HK/9/98）处在同一进化分支。聚合酶蛋白（PA、PB2、PB1）中,PB1从33-47位存在15个连续碱基缺失,是首次报道该基因ORF内存在缺失,从遗传进化上和近年来分离的H5N1亚型流感病毒处在同一分支上;PA基因从遗传进化上和PB1基因类似;PB2基因与常见的流感病毒毒株的遗传进化关系较远,在相应的进化树另成分支。因此,A／Chicken／Zhejiang／HJ／2007(H9N2)是由不同流感病毒基因亚系间发生自然重排的产物。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/Duck/FuJian/01/02株感染性克隆构建

摘 要：1999-2002年本试验室从我国南方健康鸭体内分离到21株H5N1亚型禽流感病毒,对其进行系统地生物学特性和遗传演化分析发现,其中A/Duck/FuJian/01/02(简DKFJ)和A/Duck/Guangxi/53/02(简DKGX) 属于同一基因型, 对鸡都呈高致病性,但对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性明显不同: DKGX对小鼠呈低致病性（MLD50>106.5）,DKGX株反向基因操作系统本试验室已经建立,而DKFJ对小鼠呈高致病性（MLD50<100.5）。为了研究这两株病毒对哺乳动物模型Balb/c小鼠致病性差异的分子机制,本研究构建了对DKFJ的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染技术成功拯救了该病毒（R-DKFJ）。R-DKFJ在对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性保持了与亲本野生毒（W-DKFJ, MLD50<100.5）一致的生物学特性,并且对小鼠呈全身感染,即106EID50鼻腔感染小鼠后第三天在脑、脾、肾、肺脏等脏器检测到病毒。DKFJ反向基因操作系统的成功建立为阐明H5N1亚型禽流感病毒对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病机制等方面奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素在昆虫杆状病毒系统中表达与活性鉴定

摘要：本实验从质粒pGEM-HA中扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建转移载体pFastBacHT-HA并与E.coliDH10Bac中的Bacmid质粒重组，构建重组转座质粒rBacmid-HA。在脂质体介导下将rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达HA蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot和血细胞吸附实验鉴定重组蛋白。结果显示重组HA蛋白分子量约为66kDa，该蛋白与AIV H5亚型鸡血清发生特异性反应，与H7、H9亚型鸡血清不反应，转染重组杆状病毒后的细胞能吸附鸡的红血球，证明HA基因在sf9昆虫细胞中获得了正确表达，不仅具有型特异性，而且有良好的生物反应性。     

H9亚型禽流感病毒环介导等温扩增检测方法的建立与荧光指示剂的应用

利用反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了一种特异、灵敏、便捷的H9亚型禽流感病毒(H9subtype of avian influenza virus,H9-AIV)的检测方法。该方法使用了对应于H9亚型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin HA)基因的8个不同区域的6条特异引物,在63℃的等温条件下反应,最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段,较RT-PCR方法敏感10倍。通过对15种H亚型禽流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的检测表明,该方法具有良好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与Mn2+的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定,并且其判断结果与浊度判断结果一致。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测,RT-LAMP与RT-PCR检出阳性样本数分别为61份和46份,表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR。     

一株对小鼠具有高致病性的H5N1亚型禽流感病毒的拯救

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus)正在逐渐获得突破种间屏障感染哺乳动物的能力,揭示其获得此种能力的分子机制已经成为禽流感病毒的研究热点。A/Chicken/Guangdong/04(H5N1)是一株高致病性禽流感病毒,同时对BALB/c小鼠也具有高致病力。实验通过反向遗传操作技术对该病毒进行拯救,获得了拯救毒R-A/Chicken/Guangdong/04(R-CG)。R-CG与其亲本毒A/Chicken/Guangdong/04(W-CG)在胚半数感染量(EID50)、细胞培养半数感染量(TCID50)、对SPF鸡和BALB/c小鼠致病力等生物学特性保持一致。即R-CG与W-CG对鸡都为高致病力,静脉接种指数分别为2.88和2.91;R-CG与W-CG一样,以106EID50鼻腔感染BALB/c小鼠后,均能引起小鼠死亡,在小鼠脑、肺、肾和脾脏中都能分离到病毒,说明拯救的病毒与亲本毒一样,都可在小鼠体内有效复制,对小鼠具有高致病性。本实验成功地拯救了A/Chicken/Guangdong/04,拯救病毒R-CG可作为背景毒株,为研究禽流感病毒突破种间屏障感染哺乳动物的分子机制奠定了实验基础。     

实时荧光定量PCR方法检测大肠杆菌O157:H7

针对大肠杆菌(Escherichia coli )O157:H7的致病基因eae设计了特异性引物，并用荧光染料SYBR GreenⅠ 进行了实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）。熔解曲线显示产物特异性较强，无非目的条带和二聚体产生。并对反应程序进行了优化，确定了最佳的反应程序，最终在合适的模板浓度内得出了标准曲线。结果显示Real-time PCR 比普通PCR灵敏1 000倍。     

一种新型对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒复合快速检测技术-二温式多重PCR的建立

摘要：本研究建立了一种二温式多重PCR技术，用于对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus ,WSSV）和桃拉综合症病毒(taura syndrome virus ,TSV)的复合检测。根据对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因序列分别设计了两对特异引物F1 、R1和 F1、 R2，利用该PCR能特异扩增出WSSV和TSV基因片段，结果表明：二温式多重PCR技术具有较高的特异性和敏感性，最低能检测到WSSV核酸模板10pg,TSV核酸模板100pg，且对其它一些对虾病原呈现阴性。     

H5N1型禽流感病毒血凝素HA1蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示及其免疫原性

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示H5N1型禽流感病毒HA1蛋白的可行性及其免疫原性，为研制既安全有效又能常温长期保藏和运输的禽流感口服基因工程疫苗奠定基础。用部分ha1基因（ha1p）代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段，构建了融合基因ctc-ha1p和 csa-ctc-ha1p；利用电脉冲转化法将含融合基因的重组质粒转入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中，获得了重组菌株BCCH（含ctc-ha1p，并导入一个载有协助细胞表面展示的csaAB操纵子的质粒）和CH（含csa-ctc-ha1p）。通过血凝和血凝抑制试验以及小鼠免疫学实验证实，2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组HA1蛋白并具有一定的特异性和免疫原性，其中，CH的效果强于BCCH，说明csa-ctc-ha1p这种融合基因的构建方式更胜一筹。研究结果表明，苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可用来研制禽流感口服疫苗。     

利用流体细胞测量法测定烟草花叶病毒的初步研究

描述用流体细胞测量法检测烟草花叶病毒（TMV）。测试的病毒先用乳胶微粒（直径3μm）吸附,后与TMV抗体和标有荧光色素的抗体结合,最后用流体细胞测量仪检测。试验结果表明,用本法可以测出10ng／mL的病毒,而用酶联免疫吸附法（ELISA）只能测出100ng／mL的病毒。     

基于HJ-1A/B-CCD影像的湖北省冬小麦和油菜分布信息的提取方法

利用不同时期HJ-1 A/B-CCD影像提取湖北省冬小麦和油菜分布信息.计算冬小麦、油菜不同生长期的NDVI曲线,通过野外调查和测量,获取冬小麦、油菜和其它典型地物的光谱特征.确定CCD影像提取冬小麦和油菜信息的最佳时相及不同地物在CCD影像上的色彩特征.采取最大似然分类法,对CCD影像进行分类,提取冬小麦、油菜分布信息.结果表明,HJ-1 A/B-CCD影像提取精度达95.48％,可以用于提取冬小麦、油菜分布信息;对于湖北省而言,3月中、下旬(冬小麦拔节、油菜开花)是HJ卫星提取冬小麦、油菜信息的最佳时相;在最佳时相内,冬小麦和油菜具有不同的光谱特征和CCD影像色彩特点,且样本分布服从近似正态分布,可以用最大似然方法提取其信息.     

A GC/MS method for the assessment of N and C incorporation into soil amino acid enantiomers

Identifying the transformation process of amino acid enantiomers was essential to probe into the fate, turnover and aging of soil nitrogen due to their important roles in the biogeochemical cycling. If this can be achieved by differentiating between the newly biosynthesized and the inherent compounds in soil, then the isotope tracer method can be considered most valid. We thereby developed a gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) method to trace the ¹⁵N or ¹³C isotope incorporation into soil amino acid enantiomers after being incubated with ¹⁵NH₄⁺ or U-¹³C-glucose substrates. The most significant fragments (F) as well as the related minor ions were monitored by the full scan mode and the isotope enrichment in amino acids was estimated by calculating the atom percentage excess (APE). ¹⁵NH₄⁺ incorporation was evaluated according to the relative abundance increase of m/z F+1 to F for neutral and acidic amino acids and F+2 to F (mass 439) for lysine. The assessment of ¹³C enrichment in soil amino acids was more complicated than that of ¹⁵N due to multi-carbon atoms in amino acid molecules. The abundance ratio increment of m/z F+n to F (n is the original skeleton carbon number in each fragment) indicated the direct conversion from the added glucose to amino acids, but the total isotope incorporation from the added ¹³C can only be calculated according to all target isotope fragments, i.e. the abundance ratio increment summation from m/z (Fa+1) through m/z (Fa+T) represented the total incorporation of the added ¹³C (Fa is the fragment containing all original skeleton carbons and T is the carbon number in the amino acid molecule). This method has a great advantage especially for the evaluation of high-abundance isotope enrichment in organic compounds compared with GC/C/IRMS. And in principle, this technique is also valid for amino acids besides enantiomers if stereoisomers are not concerned. Our assessment approach could shine a light on investigating the biochemical mechanism of microbial transformation of N and C in soils of terrestrial ecosystem.