猪瘟野毒不同代次E2基因主要抗原编码区序列差异分析

利用RT－PCR及序列测定对5株猪瘟野毒14个不同代次毒株E2基因主要抗原编码区序列进行了分析。结果表明每个野毒的不同代次毒株核苷酸及氨基酸序列均呈现较高的保守性，核苷酸及氨基酸序列均无变化，核苷及氨基酸同源性均为100%。与02号野毒相比，其他4株野毒核苷酸及氨基酸同源性分别为82.0%-99.5%、84.1%-98.6%。遗传衍化分析结果表明所有毒株被分成2个基因组，每个基因组又分成2个基因亚组。03、05和22号毒株位于第一基因组，02、06号毒株位于第二基因组。每一个毒株的不同代次毒株均位于同一基因组、同一基因亚组。证实了猪瘟病毒分子结构的遗传稳定性。     

23株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列差异分析

用RT－PCR及测序获得了17株猪瘟病毒（HCV）215bp的E2基因主要抗原编码区序列，经DNAStar软件对获得的17株HCV及已发表的6株HCV毒株序列进行了比较和分析，并构建了HCV遗传发生树。结果，这23株与石门株的序列相比，所有毒株的碱基变化随机地分布于整个序列，无缺失和插入，其中变化较大的区域位于序列的3’端。23株HCV E2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别74．1％－100％、79．7％－100％，其中4株20世纪70－80年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为76．3％－86．2％、81．1％－87．8％，10株20世纪90年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为75．4％－100％、79．7％－100％。所绘制的遗传发生树分为2个组群（group），每个组群分为2个亚组群（subgroup），14株猪瘟（HC）流行毒株在2个组群中均有分布，20世纪70－80年代分离的3株（75％）在组群2，20世纪90年代分离的5株（50％）在组群1。     

不同批猪瘟活疫苗中猪瘟兔化弱毒E2基因主要抗原编码区序列分析

对12批猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒病毒，以RT-PCR获得了E2基因的主要编码区的大约250bp大小的节片，在DNAstar上对这些节片的211pb进行了测序，观察到这些节片的编码序列高度同源性，其核苷酸序列和氨基酸序列有98.1%-100%相同，其中9批完全一致，结果表明猪瘟兔毒疫苗株的分子结构极其稳定。     

猪瘟病毒石门株E2基因的RT-PCR克隆及鉴定

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从感染猪血中成功扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株Ｅ２基因,大小为１１８４ｂｐ,与预期大小一致。经巢式ＰＣＲ和酶切鉴定证实所扩增的片段为Ｅ２基因特异性片段。将扩增的Ｅ２基因克隆到Ｐ＾ＧＥＭ－Ｔ载体,采用限制性内切酶鉴定和ＰＣＲ技术了阳性重组子。     

急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析

利用反转录（RT）及套式PCR（N-PCR）扩增并测定了6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C-株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明，6株流行野毒与C-株疫苗毒的核苷酸同源性为82%-84%，流行野毒之间的核苷酸同源性在89%-99%之间，并且明显可分为二个组群，病毒株所属组群与其临床症状有一定的相关性。流行野毒与C-株毒在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异，可能影响C-株毒对流行野毒的中和滴度。     

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门(Shimen)株进行了比较分析。结果显示，GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为82．1％和82．6％，推导氨基酸序列的同源性分别为87．9％和88．7％；GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为83．6％和84．0％，推导氨基酸序列的同源性分别为89．3％和90．1％。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增,其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段.经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定,并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明,所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高,而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低,基因型差异比较明显,并不归属于同一个基因亚群.本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列和氨基酸序列分析,揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景.     

异源猪瘟病毒C株E2基因保护性抗原编码区的序列分析与比较

应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了我国南京、成都、吉林３个兽医生物制品厂提供的猪瘟病毒兔化弱毒株（Ｃ株）的Ｅ２基因保护性抗原编码区,然后将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,用Ｓａｎｇｅｒ′ｓ双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行了序列分析。将测得的这３个厂生产的Ｃ株的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与作者实验室测得的国内石门株和国外测得的Ｃ株相同区域进行同源性比较,发现不同来源的Ｃ株及石门株之间存在不同程度的差异,核苷酸同源性为９３．６％～９９．６％,氨基酸同源性为９０．６％～９８．９％。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增，其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段。经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定，并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明，所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高，而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低，基因型差异比较明显，并不归属于同一个基因亚群。本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列的氨基酸序列分析，揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA，根据已报道的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）、套组聚合酶链式反应（nPCR)及测序技术，对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNAstar软件比较分析了5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株（C－ST株）E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现，5株野毒与C－ST株核苷酸序列的同源性为81．7％－83．1％，氨基酸同源性为87．3％－88．6％，表明它们之间存在较大的差异；但5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达98．8％－99．3％，氨基酸同源性为96．6％－99．2％，表明它们之间的差异较小。     

猪瘟病毒石门株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计合成了9对引物，通过RT-PCR从感染猪瘟病毒的猪全血中扩增得到了覆盖猪瘟病毒石门株基因组全长的9个cDNA片段，将所得片段分别克隆至pOK12载体和pMD18-T载体，经测序和拼接后，获得了猪瘟病毒石门株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟病毒石门株基因组全长12297个碱基，含有一个大的开放阅读框架，编码1个由3898个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其5’非编码区（5＇UTR）和3’非编码区3’（UTR）分别由373和227个碱基组成，与已发表的2个猪瘟病毒石门株的全序列相比，核苷酸同源性分别为99．4％和99，6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．7％，在3’末端第12133位T碱基发生缺失。比较了27个猪瘟病毒全序列的3’UTR，结果提示12133位碱基T缺失区域可能是猪瘟病毒的高变异区。     

猪瘟病毒兔化弱毒株与内蒙古分离野毒株(NMW)E2(gp55)基因的克隆与序列分析

采用反转录PCR（RT—PcR）和套式PCR（nested-PCR）扩增了猪瘟病毒兔化弱毒株与内蒙古野毒株的E2（gp55）基因，片段长约1200bp，将PCR产物与PMD-18-T载体相连接并克隆后，经酶切、PCR鉴定后进行序列测定和分析，结果显示二者的核苷酸同源性为89．7％，这一结果表明内蒙古近期流行的猪瘟野毒株与目前使用的疫苗株在E2基因上存在一定的差异。     

不同毒株猪细小病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用PCR扩增了猪细小病毒NJ-1株、NJ-2株、7909株和Vaccine株的VP2基因,分别克隆于pGEM-TEasy载体中,测定其核苷酸序列,并推导出相应的氨基酸序列,对其核苷酸和氨基酸序列进行分析和同源性比较。所测4个序列中,NJ-1株、NJ-2株和7909株序列均为1437bp,共编码479个氨基酸;而Vaccine序列为657bp,比其他毒株缺失780bp,共编码219个氨基酸。将所得4个序列与GenBank中NADL-2株、Kresse株、China株及VR-1株相应的核苷酸及氨基酸进行同源性比较,发现其核苷酸和氨基酸的同源性分别在97.7%~99.9%和97.2%~99.2%之间,具有高度同源性;通过绘制系统进化树可知,分离自国内的China株、NJ-1株、NJ-2株、7909株及Vaccine株亲缘性最为相近,与其他毒株的亲缘关系较远。     

多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以脾毒和细胞毒总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、套式聚合酶链式反应（nPCR）及测序技术，对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNA star软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现，脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99．4％，氨基酸序列同源性为99．0％，细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98．3％，氨基酸同源性96．7％。由此说明猪瘟病毒经猪多次传代和致细胞病变后均保持遗传的稳定性。     

猪瘟病毒的分离鉴定及其E2基因序列分析

2004~2005年上海和江苏3家猪场发生仔猪急性死亡,用ELISA鉴别试剂盒证明为猪瘟感染。用PK15细胞分离病毒,传代至第3代无细胞病变,RT-PCR扩增E2基因为阳性,扩增片段经纯化后克隆入T载体并进行序列测定。通过DNAStar软件对3株病毒的基因序列进行了比较,同时构建了系统进化树,结果表明,三株病毒分离株均扩增出269bp片段并且核苷酸序列100%同源,这3株与Alfort、Shimen株、兔化弱毒株(HCLV)和Brescia4个标准毒株核苷酸序列同源性均在90%以上,说明在江苏、上海地区分离得到的3株猪瘟病毒与流行毒株在基因序列上没有发生大的变异。     

A comparison of the pathogenicity of two strains of hog cholera virus: 2. Virological studies

Quantitative and qualitative differences were demonstrated in the amount of virus in a range of tissues from pigs infected with either the Weybridge or New South Wales (NSW) strains of hog cholera (HC) virus. The titre of the Weybridge strain in samples, as assessed by either virus titration in cell culture or by the density of specific fluorescing cells in tissue sections, was higher than that for the NSW strain. This correlated with the greater severity of the clinico-pathological syndrome induced by the Weybridge strain. The implications of the differences in the virus content of tissues in the diagnosis of HC is discussed as is the use of monoclonal antibodies to differentiate HC and bovine virus diarrhoea viruses.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株NSP2基因的序列分析

为了分析河北省流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2基因的变异情况,试验对2009年采自秦唐部分地区和廊坊地区的临床发病猪肺组织提取RNA,通过RT-PCR扩增样本中PRRSV的NSP2全序列,并对其进行生物信息学分析,应用DNAStar软件将其与VR-2332、CH-la、MLV、BJ-4、HB-1、HB-2、JXA1、HUB1、HEB1等毒株进行序列比对。结果表明:河北地方株NSP2基因全长2 850 bp,编码的氨基酸均缺失30个不连续的氨基酸;其与国内2006—2007年间分离的JXA1、HUB1、HEB1等高致病毒株亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远。     

广东省两株猪源戊型肝炎病毒的分离鉴定及其全基因序列分析

为进一步了解广东省近年猪戊型肝炎病毒(HEV)基因组特点及其演化情况,本研究于2010年～2011年间从广东省不同地区猪场收集的69份病猪胆汁样品中,分离得到两株猪源HEV(命名为SS19和ZS11).采用通用引物通过PCR方法扩增病毒的全基因序列.应用DNAStar和MEGA 5基因分析软件,将分离株与24株不同基因型的HEV参考序列进行核苷酸全序列比对和遗传进化分析.结果显示,分离的两株猪源HEV SS19和ZS11的核苷酸序列相似性为95.6％,两个病毒分离株与基因Ⅳ型HEV各参考病毒株核苷酸序列最为接近,其相似性分别为83.2 ％～94.5％和83.6 ％～94.6％,并且均属于基因Ⅳ型HEV.实验结果表明,广东省HEV流行病毒株仍以基因Ⅳ型为主,病毒株之间存在一定的地域局限性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离经典株与变异株的全基因组序列分析

通过分段设计引物,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LX、JX株基因组进行RT-PCR扩增,对各片段cDNA进行克隆和序列测定,拼接后获得全基因组序列。结果,PRRSV LX株全基因组序列长度为15 412 bp(不包括PolyA尾),PRRSV JX株全基因组序列长度为15 320 bp(不包括PolyA尾)。序列分析表明,JX株全基因组核苷酸序列与LX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、98.6%、91.0%、94.6%、90.9%、61.7%;LX株全基因组核苷酸序列与JX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、89.7%、99.7%、91.5%、99.7%、62.2%。对不同分离株的5′-UTR、Nsp2进行了序列比较,并根据5′-UTR、Nsp2、ORF5的基因序列和氨基酸序列,对国内外分离株进行了系统进化分析。根据5′-UTR核苷酸序列,可将PRRSV美洲型毒株分为4个亚群,LX株和JX株分别属于经典美洲型和"高热病"变异型。根据Nsp2氨基酸序列分析了不同分离株的分子进化关系,表明依据Nsp2序列美洲型分离株可初步划分为5个亚群,JX株独立于其他毒株,独自处于一个分支。依据ORF5序列也可将美洲型分离株划分为5个亚群。本研究为探讨PRRSV的分子进化奠定了基础。