一种简便快速高效的DNA银染方法

以葡萄叶片为试材,对变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中DNA银染及显色方法进行了改良,改良后的方法省略了预处理、固定、用试剂终止显色过程等步骤。使用改进的显带方法得到的PAGE胶图片,DNA带型和背景具有更高的对比度和分辨率;同时操作简单,耗时短,使用试剂少。改良方法使PAGE中DNA银染显色全程时间缩短至15~20 min,且效果较好,可较好的替代常规的银染方法。     

芸芥柱头总RNA提取方法及自交亲和性相关基因mRNA差异显示分析体系研究

以芸芥自交亲和系为材料,用改进异硫氰酸胍法提取芸芥柱头总RNA.所提取的RNA完整性好、没有DNA和蛋白质等污染,完全适用于后继实验.同时对影响DDRT-PCR扩增的参数进行了筛选研究,确定了Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的浓度和扩增程序.结果表明,在25μL DDRT-PCR反应总体系中各组分的最佳量分别为:17.2μL DEPC-ddH2O;1.5μL10×PCR Buffer(Mg2+);2.0μL dNTP(各2.5mmol/L);1.0μL锚定引物H-T11 M(10 μmol);1.0μL随机引物(5μmol/L);1.5μL cDNA;0.8 μL TaqDNA Polymerase(2.5 U/μL).PCR反应程序:①94℃4 min;②30℃1 min 30 s;③72℃1 min;④94℃30 s;⑤42℃1min 30 s;⑥72℃1 min;从④到⑥35个循环;⑦72℃10 min.     

聚丙烯酰胺电泳条带中微量DNA片段的回收与再扩增方法的改进

【目的】研究聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)条带中微量DNA片段的回收和再扩增.【方法】比较了4种方法溶解聚丙烯酰胺凝胶的效果和回收微量核酸的效率.【结果和结论】Bioteke溶胶/结合液能获得极高的DNA片段回收率,可从仅含1.0~7.5 ng核酸的PAGE胶中有效回收到足量的片段;再扩增的效果与回收效率呈正相关;将液态混合液与杂质分离是成功进行再扩增的关键.本研究构建的一套快速、高效的PAGE多态性条带回收及再扩增的方法为分析生物遗传多样性成因提供了新途径.     

CHA结合DNAzyme用于沙门氏菌核酸的可视化检测

为建立简洁、灵敏、快速的食源性沙门氏菌核酸可视化检测方法,试验采用靶标催化发夹装置(Catalyzed hairpin assembly,CHA)结合功能性核酸DNAzyme的方法,设计沙门氏菌核酸发夹型抓取探针(Capture probe,CP),CP结合靶标并启动H1、H2引发CHA反应,形成DNAzyme结构并发生显色反应。试验中对CP、H1、H2最佳浓度及缓冲液pH进行优化,对灵敏度与特异性进行分析。结果表明:该方法对沙门氏菌核酸片段的可视化检测具有高特异性,灵敏度达到3.9pM,且存在一定的线性关系。说明此方法的建立可为食源性病菌可视化检测奠定相应基础。     

小麦基因组DNA快速提取及SSR标记PAGE的银染检测

为了提高SSR-PCR速率,降低试验成本,以8份抗条锈小麦幼苗为材料,比较分析了两种DNA提取方法(CTAB法和SDS法)以及两种SSR标记PAGE银染法(Sanguinetti银染法和Bassam银染法).结果表明:用CTAB法和SDS法均可获得质量较好的DNA,但CTAB法花费的时间较长,提取效率低(在相同条件下SDS法提取速度约为CTAB法的2倍);Sanguinetti银染法染色背景较浅、条带清晰、分辨率高、具有较高的多态性检出率,并且在速度上优于Bassam法,仅需30多min,而Bassam银染法染色步骤烦琐,对试剂质量和水质要求均较高,且未能染色成功.     

6个植物核糖体失活蛋白新基因片段的克隆及特征分析

通过分析多种不同来源的植物RIPs的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1、P2,对基因组进行PCR扩增,分别从海芋Araceae macrorrhiza,烟草Nicotiana tobaccum、剑麻Agavaccae aga-ve、望江南(Cassia occidentalis、那坡指天蕉Musa spp.(BB)、邻水野蕉Musa spp.(AA)中获得1个基因片段.BLAST分析表明:它们推导的氨基酸序列只与多种不同来源的RIPs有相似性.其中,与葫芦科2个代表RIP相应区段的相似性最高,与β-luffin基因的相似性分别为97.2%、98.5%、97.9%、89.4%、97.9%、97.2%,与天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的相似性分别为63.6%、64.5%、64.1%、60.8%、64.8%、和63.6%.多重序列比对发现:6个序列中分别有10、9、11、11、9、10个残基氨基酸与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,只是残基位置不一致,仅有个别残基发生了变化.所有的N-糖苷酶活性位点都在P1/P2扩增区段内.     

简并引物设计与大戟科3种植物WAX基因片段的克隆

在大戟科3种重要经济植物木薯、蓖麻、小桐子中,扩增WAX基因片段。利用CODEHOP方法设计简并引物,同时在3种植物中提取高质量的总RNA并反转录为cDNA,结果扩增在3种植物中得到特异性片段,克隆测序,并采用生物信息学技术进行序列分析。结果证明CODEHOP简并引物设计科学。同时证明WAX基因的保守性较高,在大戟科3个物种中同时得到了WAX基因片段序列信息,具有较高同源性。为以后WAX基因研究奠定重要基础。     

接合转移技术将外源DNA大片段引入变铅青链霉菌中的研究

为了发展一种将150 kb及以上的外源DNA片段引入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的有效方法,以大肠杆菌-变铅青链霉菌穿梭细菌人工染色体为载体,将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个150~180 kb的外源DNA片段期望以接合转移的方式从大肠杆菌宿主菌(Escherichia coli ET12567/p UZ8002)中横向转移入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK23菌株中。结果表明,接合转移技术能够有效地将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个外源DNA大片段引入到变铅青链霉菌基因组中并稳定传代。     

野生马蔺中和抗性有关基因片段的分离与初步分析

野生植物是宝贵资源,在生物多样性、保护生态环境和遗传育种等众多领域具有重要意义。本研究以马蔺为材料,利用保守区域序列,设计简并引物进行PCR扩增,从马蔺当中分离了一些cDNA片段,通过比较发现,其中部分片段和抗逆性有关,此结果为今后充分利用丰富的野生植物资源奠定了基础。     

球孢白僵菌蛋白酶成熟因子基因片段的克隆及其表达分析

通过mRNA差异显示技术,从蝉脱诱导培养的球孢白僵菌中分离获得了长度295 bp一种蛋白酶成熟因子的基因片段。该片段编码多肽序列与米曲霉的蛋白酶成熟因子编码氨基酸序列同源性较高,达94.44%。Realtime-PCR检测结果表明,蝉蜕诱导条件下该基因的表达量为对照的8倍左右。诱导下蛋白酶成熟因子的高效表达,表明其在白僵菌毒力相关重组菌株构建研究中可能具有重要的应用价值。