丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3／4A的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成，具有丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酶（NTpase）和螺旋酶（Helicase）的功能，在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥着重要作用．非结构蛋白NS4A，其主要功能就是作为NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，在HCV多氨酸成熟过程中发挥着不可替代的调节作用．此外，NS3／4A还参与NS5A的超磷酸化修饰过程．     

猪瘟病毒石门株NS4B基因的序列测定及分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,利用２对引物,从猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）强毒石门株感染的猪血中成功扩增了ＮＳ４Ｂ基因,片段大小分别为７５７ｂｐ和７７４ｂｐ。克隆后经酶切鉴定,自动测序和序列分析,结果显示该基因较为保守,与其他猪瘟病毒毒株均有很高的同源性,与同属的ＢＶＤＶＳＤ－１株和ＮＡＤＬ株也有较高的同源性。     

猪瘟病毒NS3蛋白对牛肾细胞生长的影响

猪瘟病毒蛋白NS3被认为与培养细胞发生病变存在紧密联系,为了进一步探讨NS3蛋白单独作用及其表达水平对培养细胞CPE发生的影响,本研究构建了2种携带NS3基因的真核表达载体,分别在牛源细胞MDBK中表达NS3蛋白,利用荧光显微镜观察宿主细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western-blot检测目的蛋白表达情况。研究结果表明,2种载体均在MDBK中成功表达NS3蛋白;其中pCD-NA3.1-NS3质粒所表达的目的蛋白量较大,并使宿主细胞表现出明显的形态学变化;细胞凋亡检测结果表明NS3蛋白大量表达的宿主细胞凋亡率显著高于对照组。猪瘟NS3蛋白可以不需要猪瘟病毒其他蛋白的参与,具有直接造成宿主细胞发生病变的能力,但较低的蛋白存在水平并不能对宿主细胞造成可检测的损伤,推测活体内若能有效干扰瘟病毒NS3蛋白的产生或其功能可能会降低猪瘟或牛病毒性腹泻-黏膜病的发病率或使临床表现减轻。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定

用E.coli原核表达并纯化的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)非结构蛋白3B免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA筛选出分泌鼠IgG的杂交瘤细胞株,将该杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水,用间接ELISA法筛选获得6株能稳定分泌抗3B蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、4B1、4D7、4E11、7B2、8B11.鉴定结果显示,4B1和4E11细胞分泌IgG1,其余4株细胞分泌IgG2b;纯化后6株腹水单抗的纯度达90%以上,对3B蛋白的ELISA滴度均可达到1:100 000以上;6株单抗均不与FMDV结构蛋白VP1和3D非结构蛋白发生反应;间接免疫荧光试验证明所制备的单抗能够识别3B蛋白;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存6个月后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定.     

FMDV非结构蛋白3A和3B的表达与反应活性分析

根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒转化宿主菌BL21,用IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测表明,3A和3B基因成功的在大肠埃希氏菌中得到了表达;通过Western blotting分析和斑点ELISA分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的] 研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法] 以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a（＋）,选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-bolt检测分析。[结果] 经SDS-PAGE和Western-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论] 该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白B细胞表位的初步筛选

GP4蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的次要结构蛋白,在病毒的复制与侵染中起重要作用。通过合成GP4蛋白的重叠多肽,采用间接ELISA、dot-ELISA的方法对GP4蛋白的B细胞表位进行初步筛选,得到1个免疫显性肽段Ⅰ(50) SCLRHGDSSSPTIRKSS (67),并对其抗体水平进行测定,为PRRSV的抗体检测及其新型表位疫苗的研究奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4细胞核定位研究

为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145～168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表达的NSP4蛋白主要分布在细胞核内,HR区是其核定位信号,NSP4蛋白通过HR区信号作用主动进入细胞核内。     

持续表达HCV NS5B的Bel-7402细胞系的构建与鉴定

HCV NS5B是HCV复制所必需的RNA依赖的RNA聚合酶和抗HCV药物的一个理想靶标,构建持续表达NS5B的肝细胞系将有助于研究HCV在肝细胞的复制机制和抗HCV药物的研发.ScaI酶切含有NS5B基因的重组表达载体pcDNA-5B,获得的线性化pcDNA-5B通过脂质体转染人肝癌细胞系Bel-7402细胞,G418筛选转染细胞.阳性细胞经基因组PCR、RT-PCR和Western Blot鉴定,证实获得持续表达NS5B的Bel-7402细胞系.体外复制试验和荧光索酶试验表明:Bel-7402细胞表达的NSSB蛋白有体外和细胞内RNA依赖的PNA聚合酶活性.持续表达有聚合酶活性的HCV NS5B的Bel-7402细胞系的建立为进一步研究NS5B催化的HCV复制机制和NS5B抑制剂的筛选奠定基础.     

HCV NS5B蛋白表达、纯化及活性测定

以HCV cDNA为模板,设计特异性扩增引物,PCR得到编码NS5B的基因,与PET-21a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta菌株,加入IPTG(终浓度0.5 mmol/L),30℃、5 h诱导表达。连续通过Ni-NTA柱、SP阳离子交换柱纯化蛋白,1 L菌液可得到1.2 mg蛋白。体外活性测定结果表明,所得蛋白具有RdRp功能,酶对底物UTP的Km值为2.06μmol/L。     

坦布苏病毒感染诱导雏鸭体内未折叠蛋白反应

[目的]检测坦布苏病毒在雏鸭体内诱导未折叠蛋白反应的信号通路(PERK、IRE1和ATF6),为揭示坦布苏病毒致病机制提供理论基础.[方法]取1日龄SPF雏鸭,腹腔接种坦布苏病毒(JS804株),于接种后12、24、36和48 h从对照组和攻毒组各取5只剖杀,分别取肝脏、心脏和脑组织,利用组织总RNA提取试剂盒提取各个...     

ERsHSP的过量表达减缓番茄体内低温诱导的UPR应答

本文对过表达内质网小分子热激蛋白（ERsHSP）的转基因番茄植株进行了抗寒性和UPR应答分析。结果表明,同对照相比,过表达ERsHSP的转基因番茄具有较强的抗寒性,其冷害症状轻,叶绿素含量的损失少,体内积累的MDA含量少,电解质外渗程度低并具有较高的净光合速率;低温能够诱导番茄体内BiP和Calnexin mRNA表达量的增加,但相同胁迫条件下,转基因番茄中BiP和Calnexin mRNA的表达量显著低于对照;处理72h时,对照中BiP和Calnexin mRNA的表达量达到最高,随后开始下降,而转基因番茄中BiP和Calnexin mRNA的表达量呈稳定上升趋势。说明过表达ERsHSP能够减缓并维持低温胁迫下转基因番茄中的UPR应答,减轻低温诱导的ER胁迫。     

响应面优化超声波辅助酶法提取小米蛋白工艺

以小米为原料,采用超声波辅助酶法提取小米蛋白,通过单因素试验研究加酶量、酶解温度、超声波功率、超声时间、酶解时间对小米蛋白提取率的影响,从而优化提取蛋白质的最佳工艺条件。在单因素试验的基础上,选取加酶量、酶解温度、超声波功率为影响小米蛋白提取率的主要因素,以提取率为响应值进行分析,构建数学回归模型。结果表明:提取的最佳工艺条件:酶解温度为43℃、加酶量为2.5%,超声波功率为420 W,超声时间25 min,酶解时间为100 min。在此条件下得到蛋白质的提取率为43.26%,提取率明显提高。     

响应面法优化蛋白酶提取贻贝蛋白的工艺参数

以贻贝蛋白质为原料,对比研究了pH值、加酶量、物料比、时间、温度等对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和风味蛋白酶提取贻贝蛋白质的影响。结果表明,中性蛋白酶的蛋白质回收率最高。对中性蛋白酶进行优化试验,得出最佳的提取条件:pH值为6.3,加酶量为0.75%,酶解温度为42.9℃,184.9 min的酶解时间,可得到最大蛋白质回收率(72.2%)。通过氨基酸全自动分析仪分析,得出氨基酸含量酶解前后变化了1.453%。