鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.     

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPV-SF02毒株的基因组RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出HN基因片段，然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后，对阳性克隆进行测序；测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列，所测GPV-SF02毒株与参考毒株NL-96核苷酸序列的同源性为86%。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

鹅副粘病毒HZ株F蛋白基因的克隆及序列分析

以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出F基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中。经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆,并进行序列测定验证。结果表明,该基因由1 662个核苷酸组成,共编码553个氨基酸。与GenBank下载的9株参考毒株的F基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、F48E9、Lasota等毒株的核苷酸同源性分别为98.3%、85.4%、82.7%;氨基酸同源性分别为97.8%、90.6%、88.1%。说明HZ株与经典的鸡新城疫病毒(NDV)在F基因上存在很大的差异,而与近年来的分离株亲缘关系较近。     

鹅副黏病毒辽宁分离株HN基因的克隆与序列分析

采用RT—PCR技术对鹅副黏病毒辽宁分离株DG-01的HN基因进行了扩增，获得了1条1．8kb的特异性条带。将此扩增产物克隆至pGEM—T载体，重组克隆质粒经鉴定后进行DNA序列测定。测序结果表明，所克隆的基因片段长度为1810bp，含有1个1716bp的开放性阅读框架，编码571个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：DG-01株与我国其他9株鹅副黏病毒的同源性为89．9％～95．1％；与国内外NDVHN基因的同源性为82．1％～95．2％，与国内标准强毒F48E9的同源性为84．79／6，与Taiwan95和NL／96株的同源性分别为94．1％和95．2％。     

禽副粘病毒-2型标准毒株与不同分离株HN基因的序列测定及分析

提取实验室保存禽副粘病毒-2标准毒株Yucaipa株和3株分离毒株F4、F6、F8株的RNA，经RT—PCR，获得4株毒株的HN基因，同时测得F基因与HN基因之间的序列。序列分析结果表明，HN基因的ORF全长为1743 nt，编码一个由580个氨基酸组成的蛋白。运用DNAMAN软件分析，4株毒株与GenBank上已发表毒株的HN基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性相比，同源率分别为99．89％和99．69％。分析F基因与HN基因间序列发现两基因间序列与副粘病毒科其他病毒的基因间序列相似，含有基因起始信号和终止信号，但不含3个碱基的连接序列。通过序列分析，在分子水平上进一步证实分离于同一批进口七彩文鸟的F4、F6株是抗原性存在差异的两个毒株。毒株间的血清学关系与分子水平的核苷酸序列、氨基酸序列的比较关系一致。     

新城疫病毒四平株HN蛋白基因的克隆与序列分析

新城疫病毒（ＨＤＶ）四平株在鸡胚增殖后纯化，提取ＲＮＡ，然后利用特异性引物，经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ四平株的全长ＨＮ基因。将该ＨＮ基因插入ｐＫＳ后测序。序列分析表明，该ＨＮ基因核苷酸长度为１７４２ｂｐ，编码５７１个氨基酸，序列中有５个糖基化位点，１２个半胱氨酸残基。同源性分析表明，四平株ＨＮ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＨＮ基因相比，核苷酸序鲁同源性在８３．４￣８９．２％之间，推导的氨基     

10株新城疫病毒广西分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

根据基因库(GenBank)新城疫病毒(NDV)的HN基因序列设计了2对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000~2003年暴发新城疫的鸡群中分离的10株NDV毒株的HN基因进行了扩增,扩增产物克隆并测序,拼接出10个NDV广西分离株的HN基因全序列,其序列全长均为1 713 bp,编码571个氨基酸,均有13个半胱氨酸残基。其中GX8/03有6个糖基化位点,而GX2/00、GX6/02、GX7/02和GX5/00有5个糖基化位点,GX1/00、GX3/00、GX4/00和GX9/03有4个糖基化位点。除GX5/00和GX10/03分离株外,其他8个NDV分离株在HN基因抗原位点Ⅰ发生变异,即347位由谷氨酸(E)被甘氨酸(G)替代,GX8/03分离株在HN基因抗原位点Ⅱ的495位由赖氨酸(K)替代谷氨酸(E)。与11株已发表的NDV HN基因全序列相比较,其核苷酸同源性在79.6%~97.9%之间,推导的氨基酸同源性在87.2%~98.1%之间。     

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段。并将其克隆至pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明，6个NDV分离株HN基因片段长度均为1704bp，编码568个氨基酸；彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为96．0％～99．8％和98．6％～100％，与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为96．8％～98．4％；但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低，为88．2％～91．0％。     

伪狂犬病病毒上海株的gI基因的克隆和序列分析

参考Genebank发表的伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV)的gI糖蛋白基因序列，自行设计合成一对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，呈现一条约960bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，并进行序列测定，与PRV Rice株gI基因比较发现，核苷酸的同源性为94．7％，氨基酸的同源性为91．3％，证实为gI基因。     

小球隐孢子虫gp15基因的克隆与核苷酸序列分析

为了给小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)核酸疫苗的研制提供基因材料，用聚合酶链式反应(PCR)技术，从牛源小球隐孢子虫基因组中扩增了子孢子表面蛋白CPl5的gpl5基因(413bp)，然后将其克隆到pMDl8-T载体中，用Sanger’s双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行序列分析。将测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与国外报道的序列进行同源性比较，结果表明核苷酸同源性为99．2％，氨基酸同源性为100％。     

新城疫病毒西藏分离株HN基因克隆与序列分析

为确定西藏新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株HN基因结构特征及其与已知毒株的遗传相关性,本试验应用RT-PCR技术对西藏NDV分离株HN基因进行扩增,然后克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外代表性毒株和当前疫苗株进行比对及系统发育分析。结果表明,NDV分离株HN基因片段长度为1734 bp, 编码577个氨基酸;推导的氨基酸序列均有5个糖基化位点, XZ10和XZ17有12个半胱氨酸残基,XZ20只有11个半胱氨酸残基。NDV西藏分离株HN基因与国内代表性毒株核苷酸同源性在81.1%~93.0%之间,氨基酸同源性在81.1%~93.6%之间;与疫苗株核苷酸同源性在87.8%~98.7%之间,氨基酸同源性在88.0%~98.9%之间。系统进化分析结果表明,NDV西藏分离株HN基因均属于Ⅱ型。     

抗ICAM-1单链抗体基因的克隆及序列分析

应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 ICAM- 1单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 F12中 ,扩增出抗体VH和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆到 p MD18- T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 74 4 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排鼠抗体可变区基因特征。 VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (B)和轻链к 家族     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆及序列分析

参照已发表的猪圆环病毒II型(Porcinecircovirustype2,PCV2)基因序列,设计合成了一对引物,对PCV2北京株(Shy)ORF2基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约720bp的特异条带,将其回收后克隆入pGEM-TEasy载体中,并进行序列测定,与加拿大PCV2株(基因序列号AF027217)ORF2基因比较发现,核苷酸的同源性达99.3%,氨基酸的同源性为98.3%,证实为PCV2-ORF2基因。     

华南地区三株新城疫地方强毒株的序列测定及其系统发育分析

用设计的特异性引物，通过一步法RT-PCR扩增出5个毒株的897bp片段，对其中的3株病毒cDNA分析表明：各毒株的半胱胺酸位点和个数及糖化位点基本没有改变。各毒株在抗原决定簇氨基酸位点HN基因346-353处的碱基突变甚多，且氨基酸也出现了部分的突变。针对HN基因897bp片段构建了相应的系统发育树，系统发育分析表明：中国（华南）地区NDV各毒株与欧美国家的Ⅱ至Ⅴ基因群明显分离，遗传规律较远；NDV-WS1和NDV-HY与台湾省NDV各毒株归属为一组，与中国毒株的遗传距离较近，均属新近出现的基因型Ⅶ型，NDⅦ型在远东和西欧（Ⅶb）和及中东和南非（Ⅶa）广泛存在，可能形成了ND的第4次大流行。这些一方面说明NDV的变异可能已突破种源屏障，在鸡与鹅之间进行相互传播；另一方面说明中国古老的NDV毒株仍然持续存在，并逐渐向强毒株突变，与其他新出现的基因型毒株“共循环“。     

水貂黑素皮质素受体-4基因部分序列的克隆测序

对水貂黑素皮质素受体-4(MC4R)基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展水貂MC4R基因与其肥胖性状的相关分析及基因定位等研究提供理论基础。首先采用特定引物对水貂MC4R基因进行PCR扩增、克隆和测序,然后用DNAMAN软件拼接MC4R基因全序列,并进行序列的同源性分析。试验获得水貂MC4R基因序列816 bp。水貂MC4R基因序列与同一种属的水獭的同源性最高,达96%,而与犬、狐、大熊猫、河马、野猪、山羊、人及小鼠这些哺乳动物的同源性在89%～95%之间,另外,与贝加尔湖海豹和加州海狮的同源性也较高,均为94%。本研究成功克隆了水貂的MC4R基因,结果表明,其在物种间具有较高的保守性。     

番鸭细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考GenBank发表的MDPVFM株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出MDPVS1株NS2基因,目的片段长约1.3 kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明,MDPVS1株NS2基因全长1357 bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的MDPVFM株相比核苷酸序列同源性为99.26%,推导氨基酸序列同源性为98.23%。