蛇四棘食道口线虫线粒体cox1 基因的克隆及序列分析

本研究旨在分析长沙市四棘食道口线虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)的遗传变异情况。应用聚合酶链反应(PCR)扩增四棘食道口线虫虫株的pcox1,应用Clustal X 1.83程序对序列进行比对,同时利用DNAStar 5.0中的MegAlign程序进行同源性分析,并与GenBank^TM中已知四棘食道口线虫相应基因序列进行比较分析。所得pcox1序列长度一致,均为393 bp,与GenBank公布的线虫相关序列进行比较分析结果表明,各个分离株与已知四棘食道口线虫相应基因的相似性分别在98%以上,与其它科线虫的相似性均小于91%。四棘食道口线虫pcox1序列种内相对保守,种间差异明显。本研究为进一步研究四棘食道口线虫的群体遗传学奠定了基础。     

蛇钩口线虫长沙分离株ITS基因的克隆及序列分析

为研究蛇钩口线虫长沙分离株的核糖体DNA (rDNA)内转录间隔区(ITS)序列的遗传变异情况,并利用ITS序列构建蛇钩口线虫与其它线虫的种群遗传关系,本研究利用PCR扩增蛇钩口线虫rDNA的ITS片段,并克隆至pGEM-T载体中进行序列测定及分析.结果显示,长沙市各分离株的ITS序列长度均为734 bp,与其它线虫的同源性均低于83.9％,而与十二指肠钩口线虫的同源性较高.本研究为蛇钩口线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

基于cox3基因分析蛇源裂头蚴种系发育关系

为分析野生蛇源裂头蚴与其它绦虫的种群遗传关系,本研究采集湖南省8个地区野生蛇肌肉中的裂头蚴,采用PCR方法对其线粒体cox3基因序列进行扩增、测序及分析。结果显示,湖南省8个裂头蚴分离株cox3基因核苷酸部分序列长度均为342 bp,其cox3基因核苷酸同源性为98.2%～100.0%,种内遗传差异性为0～1.8%,与其它科绦虫cox3基因核苷酸同源性为63.4%～73.9%,种间遗传差异较大,为26.1%～36.6%。cox3基因的系统进化分析结果显示,湖南省8个裂头蚴分离株与已知猬迭宫绦虫位于同一分支,与其它绦虫所属分支相隔较远。上述结果表明,蛇源裂头蚴线粒体cox3基因序列种内差异远低于种间差异,可以作为研究蛇源裂头蚴种系遗传变异的分子标记。本研究为蛇源裂头蚴的分子流行病学及其群体遗传研究奠定了基础。     

青海牦牛脑多头蚴的线粒体cytb和nad4基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在鉴定牦牛疑似脑多头蚴病的病原,通过PCR分子生物学方法扩增了囊泡状样品的cytb基因和nad4基因序列,并进行分子鉴定与系统发育分析。结果:经分子鉴定,病原确诊为脑多头蚴;克隆的cytb和nad4基因序列分别与GenBank上的多头带绦虫参考序列的同源性达到98.7%和99.2%以上;利用GenBank中其他带属绦虫的cytb和nad4基因序列构建系统发育树,均与已鉴定的多头带绦虫聚在同一支上,但并未形成微小分支,与其它绦虫所属分支相距较远。本研究初步分析了脑多头蚴青海分离株与其他种属之间的系统发育关系,丰富了脑多头蚴的群体遗传学研究资料,为牦牛脑多头蚴病的诊断研究等提供科学参考。     

黑龙江与广州颚口线虫幼虫分离株的形态学观察及其分子鉴定

本研究从来自黑龙江及广州地区的泥鳅中分离到10条颚口线虫幼虫,采用光学显微镜观察幼虫的形态特征,并对虫体的ITS2与CO1基因进行扩增测序、系统发育分析以鉴定虫种。结果显示10条颚口线虫幼虫头球均有3环小钩,其形态学特征与日本颚口线虫(Gnathostoma nipponicum)第3期幼虫相符。序列分析结果显示与GenBank中登录的日本颚口线虫ITS2和CO1基因的同源性分别为100%和99%。邻位连接法构建的50%一致树也均与日本颚口线虫处于同一分支。表明从黑龙江及广州地区泥鳅中分离的颚口线虫幼虫为日本颚口线虫幼虫,首次证明了中国存在日本颚口线虫。     

湖南省珍稀雉类组织滴虫核糖体18S rRNA系统进化分析

为分析珍稀雉类组织滴虫核糖体18S rRNA序列遗传变异情况,并利用18S rRNA序列分析组织滴虫与其他原虫的种群遗传关系,应用PCR技术扩增珍稀雉类异刺线虫体内组织滴虫核糖体18S rRNA基因序列,并进行测序与分析。结果表明:异刺线虫雄虫与异刺线虫雌虫体内均含有火鸡组织滴虫,且9个组织滴虫分离株核糖体18S rRNA序列片段大小基本一致,约为590 bp,各分离株之间核糖体18S rRNA序列同源性均高于99.4%,与Gen Bank中收录其他原虫相应序列同源性均低于66.8%;通过建立NJ系统发育树,9个组织滴虫分离株与Gen Bank收录的火鸡组织滴虫位于同一分支,得到明显的鉴定。核糖体18S rRNA序列种内相对保守,但种间差异明显,可作为火鸡组织滴虫的种间遗传变异研究的分子遗传标记。     

多重PCR鉴定三种颚口线虫方法的建立

为了建立快速、灵敏、可靠的鉴别颚口线虫虫种的方法,根据GenBank中发表的棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫ITS-2序列,设计了3对特异引物,建立了这3种颚口线虫的单一PCR和多重PCR检测方法,并分别对单一PCR和多重PCR方法的特异性和敏感性进行了鉴定。结果显示单一PCR和多重PCR均能特异扩增出棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫,其片段大小分别为282、358、183 bp,单一PCR对棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫虫体DNA最小检出量分别为0.2、0.01、0.01 ng/μL。对宫脂线虫、异尖线虫、棘口吸虫以及迭宫绦虫均不能进行扩增。用建立的多重PCR方法对菲律宾、印度尼西亚、黑龙江颚口线虫等12条颚口线虫DNA模板进行扩增,经鉴定菲律宾与印度尼西亚的颚口线虫为棘颚口线虫,黑龙江的颚口线虫为日本颚口线虫。鉴定结果与原虫体样本的形态鉴定和测序分析结果一致。研究显示建立的多重PCR方法具有很强的特异性和较高的敏感性,可用于棘颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫虫种的鉴定和流行病学调查。     

基于cox1基因序列分析山羊褐黄血蜱种系发育关系

为分析山羊褐黄血蜱分离株的线粒体(mt DNA)部分序列(pcox1)的遗传变异情况,并利用cox1序列分析山羊褐黄血蜱与其它蜱的种群遗传关系,本研究利用PCR扩增山羊褐黄血蜱的部分cox1片段,并对其进行测序分析。结果显示16株山羊褐黄血蜱分离株的cox1序列长度均为800 bp左右,且分离株与基因库中褐黄血蜱位于同一分支,与其它蜱类得到了很好的鉴别。本研究表明pcox1序列种内相对保守,种间差异较大,可作为山羊褐黄血蜱的种间遗传变异研究的分子遗传标记。     

金丝猴毛首线虫线粒体cox1基因序列分析

为阐明金丝猴毛首线虫线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基（cox1）基因部分（pcox1）序列的遗传变异情况,以长沙生态动物园金丝猴体内分离的毛首线虫作为研究对象,根据cox1序列构建其与其他毛首线虫的进化发育关系。使用PCR方法扩增金丝猴毛首线虫线粒体cox1,然后将所测得的序列应用Clustal X 1.81程序进行比对,最后用Mega 5.0程序NJ法绘制种系发育树。结果显示,本实验扩增获得的6条毛首线虫分离株cox1序列长度一致,均为411 bp,种内变异为0。种系发育分析结果表明,这6条毛首线虫分离株位于同一分支。鉴于金丝猴毛首线虫的cox1基因种内保守,而种间差异大（24.0%~34.1%）,因此可以作为种间鉴定检测研究的遗传标记。本研究结果为进一步研究金丝猴毛首线虫的群体遗传结构奠定了基础。     

基于nad5基因分析黑斑蛙裂头蚴种系发育关系

为分析黑斑蛙裂头蚴种系发育关系,本研究利用PCR对黑斑蛙裂头蚴湖南省分离株线粒体DNA烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列进行扩增和测序,分析其遗传变异情况。并利用软件Clustal X 2.0对其序列进行分析,研究黑斑蛙裂头蚴与其它绦虫的种群遗传关系。测序结果显示,所扩增的nad5部分序列长度一致,均为510 bp,湖南省各分离株之间相应序列的相似性在97%以上,湖南分离株与基因库中其它裂头蚴nad5序列的相似度均低于89%。由于黑斑蛙裂头蚴nad5序列种内相对保守,种间差异较大,因此可以作为黑斑蛙裂头蚴种间遗传变异研究的分子标记,从而为黑斑蛙裂头蚴的分子流行病学和进一步的分类鉴定奠定了基础。     

鸡蛔虫凉山州分离株线粒体ATP6基因的序列测定和种系发育分析

利用PCR技术,对分离自四川省凉山州17个鸡蛔虫分离株的线粒体ATP合成酶F0亚单位6基因(ATP6)的全序列进行扩增和分析。测序结果显示,所获得的鸡蛔虫ATP6全序列长度均为597bp,有25个变异位点,共检测到11个单倍型,种内变异为0.0~2.4%。种系发育树显示,所有鸡蛔虫分离株聚在同一分支,能与其他蛔虫相鉴别。结果表明,鸡蛔虫的ATP6基因序列种内变异小,种间差异大,故可作为分子标记用于鸡蛔虫的种间鉴定;鸡蛔虫凉山州分离株存在一定的遗传变异和遗传多样性。本研究结果为鸡蛔虫的分子分类、分子流行病学调查和种群遗传的进一步研究奠定了基础。     

2017年上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

为了解上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株的遗传变异情况,本研究对2017年分离的6株H9N2 AIV的8个基因片段进行RT-PCR扩增、克隆和测序,并对获得的HA基因序列进行同源性和关键位点分析.结果显示:6个分离株的HA裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;6株分离株均有8处糖基化位点;受体结合位点除198位和202位有变异外,其它位点均保守,226位氨基酸均为L,228位氨基酸均为G,因此具有与哺乳动物唾液酸α2-6受体结合的特征;所有分离株HA基因核苷酸同源性为93.4%~99.9%,氨基酸同源性为93.8%~99.5%,HA基因进化树显示上述6株分离株均属于近几年在中国鸡群中流行的h9.4.2.5分支;从8个基因片段组成方式分析这6个毒株属于G57基因型.本研究结果为H9N2亚型AIV的防控和疫苗研制提供了科学参考.     

基于pcox1基因分析黑斑蛙小吻对盲囊线虫种系发育关系

以湖南省不同地区黑斑蛙体内采集的16条小吻对盲囊线虫样品为研究对象,利用PCR对其线粒体DNA中的细胞色素c氧化酶第1亚基(cox 1)基因部分序列(pcox 1)进行扩增,分析其遗传变异情况。并利用软件Clustal X 2.0对其序列进行分析,探讨小吻对盲囊线虫与其他线虫的种群遗传关系。测序结果显示,所获得的pcox 1序列长度一致,均为400 bp,湖南省各分离株之间相应序列的相似性在97%以上,与GenBank中登录的其他小吻对盲囊线虫pcox 1序列的相似度均低于89%。结果表明,小吻对盲囊线虫pcox 1序列种内相对保守,种间差异较大,可以作为种间遗传变异研究的分子标记,从而为小吻对盲囊线虫的分子流行病学调查研究等奠定基础。     

豆状带绦虫线粒体rrnL和nad5基因的克隆及种系发育研究

本研究旨在阐明中国豆状带绦虫囊尾蚴河南分离株线粒体核糖体大亚基基因(rrnL)部分序列(prrnL)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)的遗传变异情况,并用prrnL和pnad5序列重构豆状带绦虫与其他带科绦虫的种系发育关系。采用聚合酶链式反应(PCR),扩增豆状带绦虫囊尾蚴分离株的线粒体prrnL和pnad5,将所测的序列用PAUP 4.0 Beta 10程序MP法绘制种系发育树,利用DNAStar 5.0中的MegAlign程序进行同源性分析。所获得的豆状带绦虫线粒体prrnL长度约为847 bp,pnad5为602 bp。所获rrnL序列与GenBank中豆状带绦虫相应序列的相似性为99.1%~100%,nad5为99.2%~100%;河南分离株之间rrnL序列的相似性为99.65%,nad5为99.5%;与GenBank中其他带科绦虫序列的相似度rrnL低于83.4%,nad5低于85.7%。种系发育分析结果表明,所有豆状带绦虫分离株和已知豆状带绦虫位于同一分支。由于豆状带绦虫分离株的线粒体rrnL和nad5基因序列种内很保守,种间差异较大,故可作为带科绦虫种间遗传变异研究的标记。     

脑多头蚴湖南分离株线粒体nad5基因的克隆及进化分析

本试验旨在阐明脑多头蚴湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)基因部分序列(pnad5)的遗传变异情况.利用聚合酶链反应(PCR)扩增脑多头蚴的pnad5,用ClustalX 1.81程序对序列进行比对.结果显示,所获得的pnad5序列长度均为1 153 bp,湖南分离株与已知多头带绦虫位于同一分枝.由于脑多头蚴pnad5序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为脑多头蚴的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础.     

2018年上海市活禽市场6株H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

为了解上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株的遗传变异情况,本研究对2018年分离的6株H9N2 AIV的8个基因片段进行PCR扩增、克隆和测序,并对获得的HA和NA基因序列进行同源性和关键位点分析.结果 显示:6个分离株的HA裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;并对6株分离株HA...     

基于线粒体pcox1分析头槽绦虫种系发育关系

为阐明鱼头槽绦虫线粒体中的细胞色素c氧化酶第一亚基部分序列(pcox1)的遗传多态性,研究鱼头槽绦虫种系发育关系,以湖南省部分地区鱼头槽绦虫为研究对象,通过聚合酶链式反应(PCR)对其线粒体pcox1基因进行扩增并测序。序列分析比对后,结合Gen Bank收录的头槽绦虫以及其他科绦虫的序列,共同构建系统进化树,以此分析鱼头槽绦虫种内与种间的遗传关系。结果表明:湖南各分离株的pcox1长度为389～412 bp,各分离株间的同源性为93%～100%,与Gen Bank中收录的鱼头槽绦虫的同源性为99.2%～100%,序列均位于进化树同一分支上;本次收集的21株分离株与其他种绦虫序列的同源性为70.3%～80.0%,且进化树分支相距较远。结果说明鱼头槽绦虫的pcox1在不同地区种内均相对保守,种间差异较大,可以作为种间遗传变异研究的分子标记。     

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

湖南省山羊脑多头蚴的线粒体nad1和nad4基因的序列测定及种系发育分析

本研究旨在阐明脑多头蚴湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位4基因(nad4)部分序列(pnad4)的遗传变异情况,并用pnad1和pnad4序列重构脑多头蚴与其它带科绦虫的种群遗传关系.利用聚合酶链反应(PCR)扩增脑多头蚴的pnad1和pnad4,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAstar5.0中的Megalign程序进行同源性分析.结果显示所获得的pnad1和pnad4序列长度分别均为666和887 bp,湖南分离株与已知多头带绦虫位于同一分枝.由于脑多头蚴pnad1和pnad4序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为脑多头蚴的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础.     

番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析

为进一步了解番鸭细小病毒(MDPV)基因的遗传变异特征，本试验采用分段PCR扩增法获得了2个MDPV安徽分离株(AH1901和AH1902)基因组NS和VP全长基因，并与GenBank数据库中的20个水禽细小病毒基因组序列进行了比对。序列分析显示，克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因，分别为1 884 bp和2 199 bp,VP基因核苷酸序列变异程度相对较高，而NS基因则较为保守；进化分析显示，安徽分离株AH1901和AH1902位于同一分支，二者与国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因遗传距离最近，可能来源于同一毒株，与MDPV疫苗株P1及国外分离毒株FM基因遗传距离则较远；安徽分离株AH1901和AH1902的NS基因序列同源性为99.8%,VP基因序列一致。两者的NS、VP基因序列与分离株ZJ-JH-2013的同源性最高，与重组型毒株SAAS-SHNH及安徽分离株AH1401同源性也在99.5%以上；与疫苗株P1、国外分离株FM同源性则较低，其中VP基因仅为88.9%、89.3%。本试验结果表明近年国内的MDPV分离株同源性均较高，但仍存在一定程度的基因变异，增...