猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建与鉴定

(目的)构建猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)E基因真核表达载体pCI-E,为探讨E基因的功能奠定基础。(方法)根据GenBank上已发表的PEDV CV777株序列,利用Primer5.0设计1对两端含限制性核酸内切酶EcoR I和Sal I酶切位点的特异引物,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出完整的231bp的目的基因,将目的基因与pMD19-T载体连接转化到大肠杆菌DH5α中,用测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆体。然后将纯化后的E基因插入表达载体(pCI-neo)上,并经双酶切、测序鉴定。(结果)成功构建了PEDV的pCI-E重组真核表达载体。(结论)pCI-E重组真核表达载体的构建为进一步探讨PEDV E基因的功能和分子生物学特性及PED防御新途径提供依据。     

鸭A-FABP基因的克隆及其组织表达

本文采用RT-PCR方法从35周龄母鸭脂肪组织中克隆了A-FABP基因的cDNA序列,其长度为422 bp,包含了1个399 bp的完整CDS,编码132个氨基酸。该序列与家禽（鹅、鸡）和哺乳动物（人、小鼠、猪、牛）的A-FABP基因序列约有94%和73.4%-75.7%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性为92.4%和72.0%-77.3%。半定量RT-PCR研究结果为A-FABP基因在间脑、肺和肾组织中不表达,在脂肪组织中的表达明显高于其他组织（P〈0.5）。表明A-FABP基因在动物进化中具有高度保守性,该基因的表达具有组织特异性。     

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2（HO-2）真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高（P〈0.01）,在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高（P〈0.05）。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。     

猪PHGPx基因真核表达重组质粒的构建与鉴定

从猪睾丸中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法获得PHGPxcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pMD18-T载体连接,转入E．coli DH5α中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因cDNA进一步克隆到真核表达载体pGAPZ旺A中,经PCR及序列鉴定,证实插入载...     

猪Mx1基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪Mx1基因序列设计并合成引物,对Mx1基因ORF区全长1 992个碱基进行扩增。将扩增片段与pVax1载体连接,构建pVa-Mx1-ORF真核表达载体。将构建的表达载体导入BHK-21和HEK-293细胞进行表达,用RT-PCR和间接免疫荧光对表达产物进行鉴定。结果表明,所构建的pVa-Mx1-ORF表达载体在BHK-21和HEK-293细胞中成功表达。     

猪β2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达

试验旨在构建猪β₂肾上腺素能受体（β₂ adrenergic receptor,β₂AR）基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β₂AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-β₂AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N、myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-C285S和myc-pcDNA3.1（+）-β₂AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β₂AR基因已正确重组入pcDNA3.1（+）载体中;经测序鉴定,猪β₂AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β₂AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β₂AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。     

猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因，与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接，构建重组表达载体pPIC9k—TSO18，转化大肠埃希氏菌JM109，经测序证实，基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18，用SalⅠ线性化，并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株，以甲醇进行诱导表达，SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80％以上，诱导72h目的蛋白表达量为0．5mg／mL。     

牛脂联素基因真核表达载体的构建及鉴定

为了构建牛脂联素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法扩增牛脂联素(bovine adi-ponectin,BovADPN)基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测序正确的质粒经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收目的基因片段将其定向克隆到pPICZαtA载体中,构建重组质粒pPICZαA BovADPN.结果表明:克隆的基因序列与GenBank公布的序列有100%的同源性;目的基因正向插入,阅读框正确无误,说明牛脂联素基因真核表达载体构建成功.     

大鼠BDNF基因真核表达载体的构建

从23日龄大鼠脑组织中抽提总RNA,应用RT-PCR技术扩增脑源性神经营养因子(BDNF)基因片段,将此片段克隆入T载体,酶切反应鉴定。然后双酶切BDNF-T载体和空质粒pEGFP(N1),将所获目的片段和线性空载体用T4 DNA连接酶连接,构建真核表达载体pEGFP(N1)-BDNF,并进行酶切反应鉴定及DNA测序。序列测定的结果与GenBank比较,所克隆的BDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共750 bp序列完全相同。结果表明成功构建真核表达载体pEGFP(N1)-BDNF,为进一步研究BDNF基因表达,神经系统疾病治疗和生物制药奠定基础。     

A-FABP基因内含子2多态性及A-FABP基因在鹅组织中的差异表达研究

采用PCR-RFLP技术检测160只雄性五龙鹅和172只雄性朗德鹅A-FABP基因内含子2的遗传变异,并与体重和肥肝性状进行关联分析;同时利用Real-timePCR技术检测A-FABP基因在朗德鹅10种组织中的表达情况。结果表明:克隆的五龙鹅和朗德鹅A-FABP基因内含子2序列长461bp(GenBank登录号为DQ647701、EF639390)。该扩增产物酶切后,发现有HaeⅢ-RFLP,并出现AA、AB和BB3种基因型;五龙鹅和朗德鹅的基因型频率分别为0.7、0.2、0.1与0.372、0.465、0.163。填饲的朗德鹅在体重和肥肝重上基因型AA与AB和BB之间存在显著差异(P<0.05),而五龙鹅在体重性状上3种基因型之间差异不显著(P>0.05);A-FABP基因在朗德鹅各组织中的表达量为肝>脂肪>腿肌>脾>肺>心>胸肌>肾>睾丸>脑,A-FABP基因在肝脏和脂肪的表达量之间差异不显著(P>0.05),而与其他组织的表达量相比差异显著(P<0.05)。     

牛A-FABP与SREBP1基因的组织表达规律研究

A-FABP(脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白)和SREBP1(固醇调节元件结合蛋白)是动物体内参与脂肪沉积和脂质合成的重要基因。为了研究这两种基因在牛组织中的表达规律,研究利用qRT-PCR技术检测A-FABP和SREBP1在荷斯坦牛13种组织中表达水平,并进一步比较了这两个基因在秦川牛和雪龙黑牛脂肪、肌肉和肝脏的组织中表达差异。研究结果表明A-FABP基因在脂肪组织中的表达水平远远高于其他组织,SREBP1基因在各组织中均有表达,脂肪组织的相对表达量最高。A-FABP基因在雪龙黑牛肌肉和肝脏组织中的表达量显著高于秦川牛的肌肉和肝脏(P0.05),而在脂肪组织中,秦川牛和雪龙黑牛该基因表达量无显著差异(P0.05)。SREBP1基因在雪龙黑牛肌肉和肝脏组织中的表达量显著高于秦川牛的肌肉和肝脏(P0.05),而在脂肪组织中,秦川牛表达量显著高于雪龙黑牛(P0.05)。由于A-FABP和SREBP1在脂肪中表达量最高,且它们的表达量在脂肪沉积能力不同的秦川牛和雪龙黑牛肌肉和肝脏组织中存在显著差异,故推断这两种基因在牛脂肪组织的脂质代谢过程中发挥重要作用,对脂肪的沉积和大理石花纹牛肉的形成起到一定的调控作用。     

猪RUVBL2真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

RUVBL2(RuvB-like 2)蛋白是进化上高度保守AAA+(ATPases Associated With Diverse Cellular Activities,AAA)家族成员之一,CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞被广泛地用于表达重组DNA蛋白。为探究猪睾丸组织的RUVBL2基因是否能够在CHO细胞中表达,本实验以猪睾丸组织的cDNA为模板,PCR扩增RUVBL2目的基因,并将其克隆至pIRES2-EGFP(Mammalian Expression Vectors pIRES2-EGFP)载体上,进一步转化到DH5α中,再进行PCR、酶切及测序鉴定;将重组质粒转染到CHO细胞中,再进行荧光、RT-PCR、Western blot检测。结果显示:PCR、酶切及测序都证实了RUVBL2基因正确地插入到了载体质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点;荧光、RT-PCR、Western blot也证实了RUVBL2基因在CHO细胞中的成功表达。本实验成功构建了猪的pIRES2-EGFP-RUVBL2真核表达载体,并证实了猪睾丸组织中的RUVBL2基因能够在CHO细胞中表达。     

Study on the Expression Profiles of A-FABP Gene in 5 Goat Breeds

In order to understand the regularities of A-FABP gene expression in Guizhou native goats,and to establish the theoretical basis of molecular marker assisted selection for meat quality traits,β-actin gene was used as control,expression levels of A-FABP gene in livers,kidneys,hearts,lungs,longissimus muscle,semimembranosus muscle and subcutaneous fat of Qiandongnan small Xiang goat,Guizhou White goat,Guizhou Black goat,Qianbei Ma goat and Nanjiang Yellow goat were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed that A-FABP gene was expressed in all 7 tissues of 5 goat breeds,and the expression levels of A-FABP gene mRNA were all high in subcutaneous fat of 5 goat breeds;In subcutaneous fat,which was the main tissue of A-FABP gene expression in Guizhou native goats,and in longissimus muscle and semimembranosus muscle,which were directly associated with meat production property,A-FABP gene mRNA levels were all high in Qiandongnan small Xiang goat.The results suggested that the tissue distribution patterns of A-FABP gene mRNA in Guizhou native goat breeds were similar to each other.The excellent meat quality of Qiandongnan small Xiang goat might be related with the high expression levels of A-FABP gene mRNA in it's subcutaneous fat,longissimus muscle and semimembranosus muscle.     

5种山羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因的表达谱研究

为弄清贵州地方山羊脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,A-FABP)基因mRNA的表达规律,奠定肉质性状分子标记辅助选择的理论基础,试验以β-actin基因为内参,应用实时荧光定量PCR技术检测黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊共5个山羊品种心脏、肝脏、肺脏、肾脏、背最长肌、半膜肌及皮下脂肪7个组织器官中A-FABP基因的表达.结果表明,5个山羊品种7个组织中都有A-FABP基因表达,且5个品种中皮下脂肪A-FABP基因的表达水平都较高;在贵州地方山羊A-FABP基因表达的最主要组织--皮下脂肪,以及在与产肉性能直接相关的组织--背最长肌和半膜肌中,黔东南小香羊A-FABP基因mRNA水平都较高.结果提示,贵州地方山羊A-FABP基因mRNA的组织分布模式相似,黔东南小香羊的优良肉质特性或许与其皮下脂肪、背最长肌和半膜肌中A-FABP基因的高表达有关.     

陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1，GPR1）基因真核表达载体，并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后，使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-N1-GPR1进行鉴定，并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA，实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况；提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA，实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明，陆川猪GPR1基因CDS全长1 068 bp，成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体，重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光，且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实，GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组（P<0.01）。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高，在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达，在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，并获得了GPR1基因组织表达谱，为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。     

脂肪型和瘦肉型北京鸭A-FABP基因组织表达特征

本实验旨在研究A-FABP基因在脂肪型和瘦肉型北京鸭不同组织的m RNA表达情况及在脂肪组织不同时期的m RNA表达差异。分别采集6周龄心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌胃、十二指肠、胸肌、腿肌组织样品,另外分别采集2、4、6、8周龄脂肪型和瘦肉型北京鸭的皮脂、腹脂样品,用荧光定量PCR方法检测该基因的m RNA表达情况。结果表明:鸭A-FABP基因主要在脂肪组织中表达,皮脂和腹脂中的表达量远远高于其他组织(P0.05),6周龄瘦肉型北京鸭A-FABP基因在不同组织中表达量顺序为皮脂腹脂肌胃十二指肠心脏腿肌胸肌脾肝肾,而脂肪型北京鸭顺序为皮脂、腹脂肌胃十二指肠心脏、腿肌胸肌、脾肝肾;且脂肪型北京鸭A-FABP基因在皮脂和腹脂中表达量显著低于瘦肉型北京鸭(P0.05);A-FABP基因在皮脂和腹脂中的表达量随着周龄的增加呈现增加的趋势。     

长白猪CIDEB基因真核表达载体构建及生物信息学分析

本研究旨在从长白猪肝脏组织中克隆与脂质存储相关的CIDEB基因编码区全长序列,并进行生物信息学分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据NCBI中的猪CIDEB基因mRNA序列(登录号:NM001112688.1)设计特异性引物,采集长白猪新鲜的肝脏组织,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物与pcDNA3.1+载体连接,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后进行生物信息学分析。结果显示:长白猪CIDEB基因编码区序列全长为660 bp,编码了219个氨基酸,与人同源性最高,为92.2%。对长白猪CIDEB蛋白进行生物信息学分析表明,CIDEB蛋白属于亲水性蛋白,不存在跨膜结构,属于CIDE-N家族成员之一,不同物种的CIDEB蛋白具有很高的保守性,其二级结构α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占44.29%、18.26%、8.22%、29.22%。本实验成功构建了CIDEB基因的全长真核表达载体,并对其核苷酸、氨基酸进行序列分析,为进一步研究和揭示长白猪CIDEB蛋白的结构与功能提供了基础材料。     

水牛KDM1A/LSD1基因的克隆分析及真核表达载体的构建

本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KDM1A基因编码区全长2 625 bp,预测编码874个氨基酸;水牛KDM1A与其他物种同源性较高且与生物分类学保持一致;其所编码蛋白分子式为C2375H3855N805O776S24,理论分子质量为56 872.11;其二级结构由19个α螺旋,47个β折叠,25个T转角和无规则卷曲组成;其高级结构在水牛、黄牛、人之间具有较高的相似性;本实验构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,转染pcDNA3.1(+)-KDM1A可以显著提高水牛耳部成纤维细胞(BFFs)中KDM1A的表达水平;还发现卵母细胞中KDM1A的表达水平显著高于BFFs。