高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对仔猪单核巨噬细胞系统影响的研究

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染对仔猪单核巨噬细胞系统的影响,本实验采用HP-PRRSV Hu N4株人工感染30日龄的健康断奶仔猪。接种后的第7 d、10 d和14 d,分别通过组织学、免疫组织化学以及免疫荧光组织化学方法对脾脏、淋巴结和肺脏组织中巨噬细胞的数量进行研究,分析病毒感染后单核巨噬细胞变化的规律。本研究实验结果显示,感染后仔猪脾脏以及淋巴结中的单核巨噬细胞逐渐增多,第14 d达到峰值;免疫组化增殖细胞核抗原(PCNA)的结果显示,在感染HP-PRRSV的仔猪肺组织和脾组织中出现大量巨噬细胞的增殖。脾组织的免疫荧光双重染色的结果显示PRRSV出现在巨噬细胞中,表明脾脏巨噬细胞是HP-PRRSV的主要靶细胞,并且诱导脾中巨噬细胞的增生。本研究对进一步研究宿主感染HP-PRRSV的天然免疫反应及阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒依赖Caspase途径诱导仔猪胸腺细胞凋亡

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Hu N4株诱导断奶仔猪胸腺细胞凋亡的分子机制,本实验通过免疫荧光技术、流式细胞术、荧光定量PCR和western blot等方法检测HP-PRRSV感染仔猪胸腺内细胞凋亡相关因子Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3表达量的变化。结果显示:HP-PRRSV感染仔猪后,胸腺内表达凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的细胞比例显著升高,并且凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3表达量也明显升高。以上结果表明:HP-PRRSV感染仔猪引起胸腺细胞凋亡是通过Caspase依赖性通路介导。本研究为进一步了解HP-PRRSV感染机制提供了实验依据。     

地塞米松对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪的影响

为研究地塞米松(DEX)对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染仔猪造成的免疫系统和呼吸系统损伤的影响,本实验在断奶仔猪感染HP-PRRSV Hu N4株前后,肌肉注射不同剂量的DEX,观察临床症状,检测其免疫系统相关指标的变化。结果显示:不同剂量DEX注射组实验猪均表现典型临床症状,虽然其外周血中的促炎性细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平降低,CD4+CD8-T淋巴细胞亚群比例较Hu N4单独感染组升高,CD8+CD4-T细胞比例较Hu N4单独感染组降低,但DEX注射组仔猪体温始终维持在40℃~42℃,肺部、胸腺和淋巴组织病变加重,死亡率达到100%(10/10),而Hu N4单独感染组仔猪死亡率仅为25%(1/4)。表明DEX对HP-PRRSV感染的断奶仔猪虽具有一定的抑制炎症反应作用,但加重了HP-PRRSV感染的不利影响。本研究为全面防控HP-PRRSV提供新的实验依据。     

高致病性PRRSV HuN4株不同代次病毒对仔猪胸腺损伤的研究

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)不同致弱代次病毒对断奶仔猪胸腺的损伤,本研究选用HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞中传代致弱的F5、F15、F23、F30代及弱毒疫苗HuN4 F112代分别接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性健康断奶仔猪。实验结果显示:HuN4 F30感染组胸腺的眼观病变、胸腺重量、病理组织学变化、病毒载量及胸腺细胞凋亡比例均与F23感染组有显著差别(p<0.05)。本实验结果表明,HuN4 F23代仍然能够引起仔猪胸腺萎缩并导致机体免疫抑制,而F30代已不能引起断奶仔猪胸腺萎缩现象。因此,HP-PRRSV HuN4 F23、F30代可以作为研究HP-PRRSV HuN4致胸腺萎缩的分子机制的关键代次。本研究为进一步研究HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺萎缩和胸腺细胞凋亡的分子机制奠定了基础。     

猪骨髓源树突状细胞体外诱导培养与鉴定

树突状细胞(DC)是机体主要的抗原递呈细胞,在固有免疫及适应性免疫中发挥重要作用。为进一步探究DC功能及诱导其分化的方法,本研究采用硬膜外腔麻醉法麻醉受试猪,以骨髓采集针从髋骨处抽取骨髓,裂解红细胞后,差速贴壁法获得前体细胞后,添加重组猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组猪白细胞介素4诱导其分化,以形态学方法和流式细胞术鉴定其特征。结果显示,骨髓前体细胞经诱导分化后具有典型的DC形态,其标记分子分化抗原簇1在第6 d和8 d阳性率分别达65.13%(p0.01)和56.5%(p0.01),标记分子二型猪白细胞抗原(SLA-IL-DR)在诱导后第6 d和8 d阳性率分别为86.87%(p0.01)和84.60%(p0.01)。本研究建立了活体猪骨髓源DC的体外分离培养和诱导分化方法,为基于DC的疾病防控研究提供依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒四川变异株致病性分析

为探究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)四川变异株SC2012和SC2012-2人工感染仔猪的病理学特征及其在组织内的分布情况,本研究将HP-PRRSV SC2012和SC2012-2株接种健康断奶仔猪,观察不同发病阶段仔猪的临床症状;感染后第14 d剖检仔猪观察其器官病变情况、组织切片的病理学变化,通过免疫组化方法(IHC)和RT-PCR方法检测PRRSV在组织中的分布情况。结果显示,两组仔猪感染后均未出现显著的呼吸症状,并于感染后3 d~5 d出现轻微腹泻;体温测定结果显示,两组仔猪均出现轻度发热、病毒血症,但SC2012-2组较SC2012组仔猪出现时间提前、病毒滴度高、维持时间长;两组仔猪均能够通过唾液、粪便、鼻分泌物排毒;剖检仔猪肺脏均出现不同程度的间质性肺炎,肝脏表现为肝淤血,其它多个器官均有不同程度的炎性细胞浸润;临床症状和病理损伤等结果表明,SC2012较SC2012-2株毒力弱。组织内病毒分布结果显示,两株病毒均在多个器官中分布,但结合组织病理变化分析显示病毒的分布并不一定导致组织损伤,HP-PRRSV四川变异株的突变对其毒力产生了一定的影响。本研究为进一步对HP-PRRSV SC2012和SC2012-2的研究提供必需参数。     

巨噬细胞极化在微生物感染中的作用研究进展

正巨噬细胞(Macrophage)起源于骨髓中的前体细胞,分化成熟的巨噬细胞广泛分布于机体各个组织和器官中~([1])。在特定因素作用下,机体内某些细胞可以直接分化成为巨噬细胞,不同细胞分化后的巨噬细胞可以分布于不同组织~([2])。巨噬细胞是参与机体固有免疫的一类重要免疫细胞,不但可     

体外弓形虫感染小鼠巨噬细胞对其极化的影响

为探索体外弓形虫感染小鼠巨噬细胞对其极化的影响,本研究采用M-CSF诱导分离的小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞,在体外以弓形虫感染骨髓来源的巨噬细胞,分别于感染后0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h收集细胞和细胞培养液,利用Griess法和Arginase活性试验对i NOS和Arginase-1的酶活性进行检测。通过荧光定量PCR和western blot方法分别从m RNA水平和蛋白水平测定巨噬细胞中i NOS和Arginase-1的表达量。结果显示,弓形虫感染巨噬细胞后细胞中的Arginase-1的m RNA和蛋白含量均显著上调表达,i NOS的m RNA虽有短暂小幅度上调,但蛋白的含量无明显变化。本研究表明弓形虫感染巨噬细胞后能够明显诱导静息状态的巨噬细胞朝向M2型的方向极化,从而改变巨噬细胞的表型和功能。本研究为进一步阐明弓形虫与机体免疫系统相互作用提供了实验依据。     

PRRSV在感染早期通过活化CREB竞争抑制p65与CBP结合

为研究细胞内cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的结合蛋白(CBP)在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染后的结合动态对Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)表达的影响,本研究利用HP-PRRSV强毒Hu N4株感染宿主细胞,采用CO-IP方法分析CREB的磷酸化情况及其结合动态。结果显示Hu N4株感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)能够引起CREB明显磷酸化,Hu N4株感染PAMs和Marc-145细胞使p38磷酸化水平显著上调,PKA通路抑制剂可以明显抑制Marc-145细胞中CREB的磷酸化水平,但不影响PAMs中CREB的磷酸化水平。并且Hu N4株感染Marc-145细胞1 h后磷酸化的CREB能够与CBP结合,并抑制了p65与CBP的结合。当抑制剂H-89和SB203580抑制Marc-145细胞中CREB的磷酸化后,CREB与CBP的结合同时受到抑制。本研究表明HP-PRRSV Hu N4株感染细胞后,可以通过激活p38 MAPK通路而活化CREB,活化的CREB与p65竞争结合CBP,而抑制p65与CBP的结合,使得HP-PRRSV在感染早期抑制了IFN-β的表达。本研究为深入研究HP-PRRSV的免疫抑制机理提供了实验依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺泡巨噬细胞的差异转录基因文库构建

为鉴定高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后,细胞内转录发生差异的基因,本研究采用抑制性消减杂交技术,以HP-PRRSV HuN4株感染后48 h的PAM细胞mRNA为实验方(Tester),以未感染的PAM细胞为驱动方(Driver)进行消减杂交,得到了HP-PRRSV HuN4株感染后PAM内转录后发生上调的基因.反之,实验方与驱动方互换进行消减杂交,得到了HP-PRRSV HuN4株感染后PAM内转录后发生下调的基因.将2种杂交所得的差异转录基因经PCR扩增后分别克隆到T载体中并转化大肠杆菌感受态细胞,从而构建了正向(上调)和反向(下调)的差异cDNA文库.随机挑取文库中的多个克隆用PCR方法进行鉴定,结果表明差异文库中的cDNA具有较好的多样性.本研究为下一步的文库克隆的序列测定与差异基因的功能分析奠定了基础.     

禽白血病病毒J亚群(ALV-J)基因表达与抗原定位的研究

本研究通过原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHC)技术检测了组织中ALV-J病毒RNA的表达及定位。原位杂交结果显示：在攻毒后3周时．所检测到的组织大部分已感染病毒；病毒对肝脏、心脏、肾脏的实质细胞、骨髓髓系细胞和卵巢基质中的间质细胞、脾脏红髓内的单核-巨噬细胞有较高的嗜性．在核膜及胞浆内显示出蓝紫色颗粒状的特异性信号，而在法氏囊、胸腺、脑和坐骨神经中检测不到病毒RNA及病毒基因的表达。免疫组化结果与原位杂交相似，在核膜及胞浆内可见蓝紫色阳性信号．瘤组织的信号较强，显示了较强的抗原性。由骨髓和其他组织的结果可推测ALV-J诱导肿瘤可能和病毒基因的插入位点有直接关系，而和病毒在组织内的数量没有直接关系。     

PRRSV感染SPF仔猪血液中细胞因子和一氧化氮的动态

利用生物学和免疫学方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ－4株感染仔猪血清中TNF－α的变化，结果显示，感染后TNF－α水平明显上升，外周血单核细胞产生Th1型细胞因子IL－2的能力增强。比色法检测仔猪感染后血浆中NO的变化，发现NO在病毒感染后略有增高。TNF－α升高可能使内皮细胞受到损伤，导致机体对其他病原体的易感性增强。NO可反馈性地抑制巨噬细胞的功能和T细胞增殖，使PRRSV感染仔猪的免疫功能受到抑制。     

RNAscope原位杂交技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA方法的建立

为了直观、高效、特异性地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞和组织中PRRSV RNA,本研究根据HP-PRRSV Hu N4株ORF7基因序列设计8对28 bp~36 bp双"Z"结构的寡核苷酸探针(PRRSV-Nprobes),建立了一种新的PRRSV RNA原位杂交检测的方法。该方法能特异性的检测PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中PRRSV RNA,而对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)感染PAMs中的核酸呈现阴性。应用该方法检测PRRSV感染仔猪肺脏、腹股沟淋巴结和胸腺石蜡包埋组织切片中PRRSV RNA,在感染的腹股沟淋巴结中PRRSV RNA呈现集中分布,而PRRSV RNA在肺脏和胸腺中呈弥漫性分布。该方法可用于细胞和组织中核酸的定位及分布规律的研究,特别是用于病毒含量较少的潜伏感染的检测,为PRRSV实验室检测和致病机理研究奠定了良好的试验基础和技术支持。     

基于RNAscope~?原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析

为扩大RNAscope~?原位杂交技术(RNAscope~?ISH)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基础研究中的应用范围,本研究将该技术与免疫组织化学技术(IHC)相结合,通过条件优化建立了RNAscope~?ISH-IHC双重染色技术。经检测不同病毒感染的组织切片中的PRRSV表明该技术具有良好的特异性。采用该双重染色技术检测PRRSV感染的猪淋巴结组织切片中巨噬细胞感染PRRSV情况,结果显示PRRSV核酸主要存在于巨噬细胞胞浆中,在胞核中也有分布,但在一些非巨噬细胞中也散在PRRSV阳性信号,表明PRRSV不仅在猪淋巴结巨噬细胞中复制。利用该双重染色技术检测PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中凋亡相关调节基因Bid、Bcl-xl表达水平,结果显示一段时间内Bid基因转录水平上调、Bcl-xl基因转录水平下调,与同条件下荧光定量PCR结果一致。综上,本研究建立的RNAscope~?ISH-IHC双重染色技术结合了RNAscope~?ISH与IHC各自的优势,不仅能够检测病毒感染后在组织中的定位,还可以分析病毒感染后宿主内源性基因转录的变化趋势,实现了在同一组织切片中对核酸与蛋白的双重检测。经验证该检测方法适用于PRRSV实验室研究,为PRRSV的相关基础研究提供新的检测手段。     

HP-PRRSV抑制猪肺eNOS表达与猪肺微血栓形成的相关性研究

为了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)与肺微血栓病变的关系及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达对微血栓的影响,选取50头70日龄的鄂通两头乌猪,4头作为正常对照,46头感染HP-PRRSV。采取50头猪的肺组织,应用HE染色观察组织病理变化并对微血栓病变程度进行等级评分,将46头感染猪分为轻度微血栓组、中度微血栓组、重度微血栓组,每组选取4头猪进行后续研究。应用免疫组化、荧光定量PCR和Western blot技术,明确HP-PRRSV和eNOS在微血栓猪肺中的表达、分布及变化。组织病理学研究结果显示感染猪肺组织肺泡间隔明显增宽,毛细血管有不同程度的淤血、出血,肺泡腔内有巨噬细胞、脱落的肺泡上皮细胞及淋巴细胞,肺泡壁有大量微血栓。HP-PRRSV主要分布于肺泡巨噬细胞及少量的淋巴细胞的细胞质。随着HP-PRRSV病毒含量的增加,微血栓病变越严重。微血栓病变越严重,死亡率越高。eNOS主要分布于肺泡Ⅱ型细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞及支气管平滑肌细胞的细胞质,感染猪肺组织的eNOS mRNA和蛋白表达显著低于未感染对照组。研究结果表明HP-PRRSV使eNOS的表达下调,并参与感染猪肺组织微血栓的形成,增加感染猪的死亡率。     

高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2) 和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。     

胞内分枝杆菌及偶发分枝杆菌对小鼠巨噬细胞凋亡的影响

为了研究非结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡的影响,采用胞内分枝杆菌和偶发分枝杆菌分别感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,流式细胞术检测细胞凋亡率,ELISA法检测TNF-α及IL-10的表达,检测这2株菌在小鼠巨噬细胞中的增殖。结果显示:胞内分枝杆菌引起的细胞凋亡水平低于偶发分枝杆菌组(P0.05),这2株菌所引起的TNF-α的表达量在4 h、12 h较高,与空白对照组相比差异显著(P0.05),在24 h、48 h下降明显,而IL-10的表达整个感染过程都比较高。并且还观察到胞内分枝杆菌的吞噬率较高(P0.05);增殖能力较强(P0.01)。表明菌体毒力与凋亡率、细胞因子的表达、增殖率有着直接关系。     

猪瘟病毒感染仔猪接种猪瘟疫苗后抗原的跟踪检测

为了解猪瘟病毒感染仔猪免疫猪瘟疫苗后带毒情况,并比较实验室几种猪瘟抗原检测方法的适用性,采用(CSFV)RT-nPCR、猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR(HCLV-FQ-PCR)和CSFV实时荧光定量RT-PCR(CSFV-FQ-PCR)3种检测方法对田间感染CSFV仔猪疫苗免疫前后带毒情况进行定期跟踪检测.结果显示:本实验室建立的CSFV-FQ-PCR灵敏度高于CSFV-RT-nPCR;猪瘟疫苗免疫48 d后,采用HCLV-FQ-PCR方法检测不到血液中的HCLV;猪瘟病毒感染猪免疫疫苗后仍存在持续带毒现象,因此对猪瘟病毒感染猪必须彻底淘汰.     

小鼠髓源未成熟树突状细胞的分离与培养

本试验旨在建立一种体外诱导培养小鼠未成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法。应用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)在体外诱导小鼠骨髓前体细胞分化为未成熟树突状细胞,进行形态学观察、细胞表型分析、刺激T细胞增殖等方法,对小鼠髓源未成熟树突状细胞的体外诱导培养进行鉴定。试验结果显示,小鼠骨髓来源的DC在体外培养8 d后,特异性细胞表面标志CD11c的表达量达到81.09%,中度表达MHCⅡ,低表达CD40、CD80、CD86。本试验成功地建立了体外小鼠髓源DC扩增的方法。     

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究

为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。