鸡毒支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡毒支原体(MG)的快速定量检测方法,本研究根据GenBank中登录的MG 16S rDNA基因序列设计了一对引物,以MG基因组DNA为模板扩增其16S rDNA基因片段,并克隆于pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒作为标准品建立了MG SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法在1.96×10~8拷贝/μL~1.96×10~2拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限可达1.96×10~1拷贝/μL;与禽类其它呼吸道病原无交叉反应,特异性良好;批内及批间变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。采用该方法抽检30份疑似临床样品,检出率为40%,敏感性明显高于常规PCR(33%)和血清平板凝集试验方法(23%),检测活疫苗可达到精确定量每头份2.0×10~7拷贝/μL。该研究为MG的早期诊断与净化、疫苗质量监测提供了一种新的快速定量检测技术。     

鸭瘟病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸭瘟病毒（DPV）快速、敏感的检测方法,本研究利用PCR技术扩增出DPV UL30基因中510bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了DPV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5×101拷贝,与鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭H9亚型流感病毒和鸭副粘病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床DPV的检测。     

犬瘟热病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

犬结核SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立

本研究基于IS1081基因建立了鉴定犬结核的SYBR Green荧光定量PCR方法.在最佳反应条件下反应效率为1.09,获得的标准曲线相关系数R值达0.999 5,标准曲线的线性范围达到1～1×107拷贝8个数量级,最低可检测到约10个目的拷贝,即31.4 fg DNA.根据溶解曲线分析,扩增产物中无引物二聚体的影响,说明所设计引物特异,退火温度合适.这表明本研究建立的SYBR Green荧光定量方法灵敏度高、定量范围广.利用该方法对临床样品进行检测,结果发现:与结核杆菌分离培养方法比较,符合率为85%.240份犬猫鼻拭子中150份被检测为阳性,这说明犬猫鼻腔中分枝杆菌携带率很高.     

香鱼假单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立香鱼假单胞菌的快速定量检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的rpo D基因序列设计了一对特异性引物,以该菌基因组DNA为模板通过PCR扩增其180 bp的rop D基因片段,并克隆于p MD18-T载体中,以纯化的重组质粒为标准品建立了香鱼假单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示在1.9×103拷贝/μL~1.9×108拷贝/μL范围内呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度可达1.9×103拷贝/μL;该方法对恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、创伤弧菌等病原菌DNA扩增结果均为阴性,特异性良好;组内和组间变异系数均小于2%,具有较高的重复性和稳定性。本研究建立的方法不仅能够快速检测香鱼假单胞菌,还能够对该病原菌感染的动态变化进行定量研究,为大黄鱼香鱼假单胞菌感染导致的内脏白点病的早期诊断及防控提供一个新的检测技术。     

猪瘟病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank已发表的HCV 5’NTR核苷酸序列设计一对特异性引物,扩增位置在整个基因的221～377位,片段长度为167bp。提取由厦门出入境检验检疫局技术中心动物实验室保存的HCV细胞毒的RNA,并反转录成cDNA,以此cDNA为模板建立了SYBR Green I实时定量PCR检测猪瘟病毒的方法,并用该方法检测送检的临床疑似病料。结果表明：本研究建立的HCV-SYBR Green I PCR特异性强,与FMDV、PCV2、PRRSV、PPV、PRV等常见猪病毒病病原没有交叉反应;灵敏度高,可以检测到5．3×10^2的病毒拷贝数;操作简单,耗时短,只需3h即可完成整个试验过程,可初步用于临床检测。     

检测猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立

猪圆环病毒2型（PCV-2）ORF2（开放阅读框2）基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。然后以该重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计PCR引物,采用两步法,建立了检测PCV-2快速简捷的SYBR Green I荧光定量PCR方法。多次试验证明,该方法具有良好的重复性。同时针对与PCV-2共感染的其它病毒进行特异性检测,进一步证明该方法可以快速、特异、灵敏地检测PCV-2。     

猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PRRSV方法的建立

根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株验证该检测方法的稳定性;以10倍梯度稀释的质粒为标准品扩增并构建标准曲线,探究该检测方法的灵敏度,随机挑取10份保存的PRRSV阳性病料和10份阴性病料同时使用农业部推荐的PRRSV RT-PCR检疫标准方法和建立的方法进行检测,以确定2种方法检测的符合率。结果显示,使用建立的方法可以在54.4℃80min内完成对PRRSV的检测,该检测方法具有特异性和稳定性;检测灵敏度为6.8×10拷贝/μL;以Ct值为横坐标,扩增序列拷贝浓度的对数值为纵坐标,得到标准曲线,方程为y=-3.411 x+39.002,R2=0.999;对随机挑取的10份PRRSV阳性病料和10份阴性病料进行检测,结果2种方法检测结果的符合率100%。结果表明,成功建立了PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。     

犬腺病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立良好的犬腺病毒检测方法,参考GenBank中犬腺病毒毒株(GenBank登录号:U77082.1)的E3基因,设计并合成了一对特异性引物。扩增的目的片段与pMD19-T载体相连接构建重组质粒,以该重组质粒为模板建立特异性好、灵敏度高且可快速检测犬腺病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。经特异性方法验证,在常见的五种犬病毒病中,本方法只能检测出犬腺病毒存在。敏感性试验结果表明,本方法的灵敏性较普通PCR方法高出100倍。重复性试验结果的变异系数均不高于0.95%。本方法的建立可为犬腺病毒的检测提供技术支持。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R²值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%～0.43%,组间变异系数为0.67%～0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。     

猪丹毒丝菌PCR检测方法的建立

根据Genbank中猪丹毒丝菌的16S rRNA基因序列的差异设计特异性引物,对6株临床分离的丹毒丝菌菌株进行PCR扩增.结果显示,此引物对6株丹毒丝茵均扩增出与预期大小472 bp相一致的片段,而对多杀性巴氏杆茵、大肠杆菌等10种病原体的扩增结果均为阴性;PCR敏感性试验结果表明,该方法可以检测到186 CFU/μL...     

环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种快速、敏感检测牛环形泰勒虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛环形泰勒虫Tams1基因序列,设计合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测牛环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,该方法可以特异地检测牛环形泰勒虫,而对牛巴贝斯虫、反刍动物艾立希体和弓形虫检测均为阴性;该方法的灵敏度可达到180拷贝/μL,比常规PCR敏感10倍;组内和组间变异系数均小于1.0%。对15份临床血液样品和20只璃眼蜱进行检测,SYBR Green I荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为42.86%和28.57%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可准确、高效检测牛环形泰勒虫,为牛环形泰勒虫病防控提供技术支持。     

小鹅瘟病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法扩增GPV VP1基因173 bp的基因片段,克隆到PMD18-T载体上,将纯化后的质粒做为模板,建立扩增反应的标准曲线,最终建立了小鹅瘟病毒(GPV)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏性高,可检测2×101拷贝/μL的模板量;特异性好,与鹅副黏病毒、鹅流感病毒、鹅源鸭瘟病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、曲霉菌均不发生交叉反应。建立的GPV荧光定量PCR具有特异性好、敏感度高、检测时间短、结果重复性好等优点,可用于小鹅瘟的临床诊断和流行病学调查。     

啮齿柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测啮齿柠檬酸杆菌(C.rodentium)esp B基因的方法,本研究根据Gen Bank中登录的C.rodentium esp B基因序列设计1对特异性引物,建立了C.rodentium SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。结果显示,在102拷贝/μL~108拷贝/μL浓度范围内标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系。该方法仅对C.rodentium进行特异性扩增,而对牛棒状杆菌、鼠伤寒沙门菌、嗜肺巴斯德杆菌、支气管鲍特杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌扩增结果均为阴性,具有良好的特异性。其检测灵敏度可达24拷贝/μL。组内和组间试验变异系数均小于1%,重复性良好。临床样品初步应用结果显示,荧光定量PCR阳性检出率为56.36%(31/55),常规PCR阳性检出率为30.91%(17/55),二者符合率为74.55%。本研究建立的C.rodentium SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法为实验动物C.rodentium的检测和流行病学调查提供了技术支撑。     

PCV4 SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型（PCV4）的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×102~5.64×109 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×102 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。     

空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是一种人兽共患病病原菌,给养殖业带来了较大经济损失。为实现对空肠弯曲杆菌的快速检测,针对其MapA基因序列设计特异性引物,优化反应条件和反应体系,建立了空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示：建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,仅能特异性扩增出空肠弯曲杆菌,对胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌无交叉反应;敏感性较强,最低检测限为6.42 copies/μL;以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验,发现组内和组间Ct值变异系数（CV）均小于2.50%,说明该方法具有良好的可重复性。结果表明,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性及重复性,可用于空肠弯曲杆菌的快速诊断和流行病学调查。     

犬瘟热病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

新型鸭细小病毒SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

本研究以新型鸭细小病毒VP3基因保守区域克隆至pMD19-T载体上获得的阳性质粒作为标准阳性质粒,建立一种检测新型鸭细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示:在5.17×10~1～5.17×10~7拷贝数呈良好的线性关系,相关系数R~2为0.999、斜率为3.595,灵敏度可达到5.17拷贝数;该方法用于检测鸭常见传染病呼肠孤(DRV)、禽流感(AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭病毒性肝炎(DHV)、鸭星状病毒(DAstV)无非特异性扩增,特异性良好;对安徽、山东、江苏等地鸭场采集的疑似病料进行初步检测,发现48份样品中阳性率达70.8%,与普通PCR方法检测结果相比,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法更灵敏。本研究成功建立了一种检测新型鸭细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量方法,为新型鸭细小病毒的监测奠定了坚实基础。     

禽呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立禽呼肠孤病毒(ARV)快速、敏感的检测方法。本研究利用RT-PCR技术扩增出ARV S1基因中298bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了ARV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达4.8×101拷贝,与NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床ARV的检测。