鸭坦布苏病毒E蛋白具有独特交叉反应性中和表位的鉴定

利用抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)中和单抗1G2,结合E蛋白多肽扫描技术,鉴定了最小抗原表位²²⁷GSSAGTWQN²³⁵。Western blot显示,残基²³¹G或²³³W的突变后,表位完全失去了与1G2抗体识别的功能,表明²³¹G或²³³W是抗体1G2识别的关键氨基酸位点。通过免疫荧光分析(IFA)显示,MAb 1G2与JEV、WNV和ZIKV的E蛋白发生交叉反应,表明该表位是黄病毒的交叉反应性表位。蛋白质和病毒模型显示,表位定位于成熟病毒粒子可接近的表面,在E蛋白结构域Ⅱ的hi环中。本研究首次证明,中和抗体1G2靶向交叉反应表位定位在E蛋白结构域Ⅱ的hi环,该表位的鉴定有助于提高对黄病毒血清诊断中存在交叉反应问题的认识和理解。     

鸭坦布苏病毒E蛋白主要抗原区域的原核表达与鉴定

根据GenBank中发表的鸭坦布苏病毒(DTMUV)基因序列,设计合成一对特异性引物,RT-PCR扩增966bp E基因片段并克隆至pMD18-T载体中,经鉴定正确后,将其定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组阳性质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,Western blot检测证明该重组蛋白可与抗血清发生反应。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Western blot试验检测结果表明,E基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。     

鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)膜前体蛋白(prM)的单克隆抗体,将原核表达的重组prM蛋白配伍佐剂免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌抗DTMUV prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3H4和5C10。2株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体,制备的腹水抗体效价分别为1∶51 200和1∶102 400。亚型鉴定结果显示,3H4和5C10单克隆抗体的重链均属于IgG2b,轻链均为Kappa型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,这2株单克隆抗体均能与BHK-21细胞中感染的DTMUV发生特异性反应,而与同属的日本脑炎病毒无交叉反应。微量病毒空斑减少中和试验结果表明,这2株单克隆抗体均具有中和活性。进一步原核表达prM蛋白不同截短体,发现2株单抗针对不同表位,均位于prM蛋白的pr片段上。本研究制备的单克隆抗体3H4和5C10为快速检测DTMUV感染和研究prM蛋白的结构与功能奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒全长E蛋白可溶性表达及免疫原性分析

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)引起的一种以产蛋量和采食量严重下降为主要特征的传染病。应用RT-PCR方法扩增DTMUV GDHD2014-3毒株的囊膜(E)蛋白全基因序列,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c5x,构建重组表达质粒E-pMAL。将其转化E.coli BL21感受态细胞,经诱导表达条件优化,在30℃条件下IPTG诱导,可溶性表达重组的全长E蛋白(rf E),大小约110 ku。用Amylose Resin对目的蛋白进行纯化,并将纯化的rf E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆血清抗体。经Nu-PAGE以及Western blot分析,成功实现rf E蛋白可溶性表达,并能与DTMUV灭活疫苗免疫鸭血清多抗产生特异性反应。间接免疫荧光试验结果表明,rf E蛋白免疫小鼠获取的多克隆血清抗体能与DTMUV反应。实现了rf E蛋白的可溶性表达及纯化,并验证rf E蛋白具有良好的免疫原性,为DTMUV的亚单位疫苗的研制以及相关诊断试剂的开发奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒JJZZ1801株分离鉴定及其E蛋白序列分析

为了解鸭群发病原因,对疑似鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染的病鸭进行剖检,采集病变组织进行特异性RT-PCR检测和病原分离鉴定。结果显示:该鸭群为DTMUV感染,从病鸭脑组织分离到一株DTMUV,命名为JZ1801;基因序列分析显示,JZ1801的E基因与泰国分离株DK/TH/CU-1的E基因同源性最高(核苷酸相似度为97.8%),在系统进化树中处于一个新的亚分支,而与我国早期DTMUV分离株同源性相对较低,与之处于不同的亚分支;氨基酸位点差异分析显示,JZ1801的E蛋白氨基酸序列与我国早期分离株FX2010和BYD-1的E蛋白均具有9个差异位点,与疫苗株FX2010-180P的E蛋白存在15个氨基酸位点差异。结果表明近年来我国鸭群中流行的DTMUV E蛋白已经发生了一定程度的变异。     

鸭坦布苏病毒E蛋白特异性抗原表位鉴定及Epitope-ELISA血清学诊断方法建立

旨在建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)的特异性血清学诊断方法。本研究以纯化的单克隆抗体1A5为固相筛选分子,利用噬菌体展示技术鉴定DTMUV囊膜(E)蛋白的特异性抗原表位,并利用DNAStar分析抗原表位序列在DTMUV中保守性和与其他黄病毒的E蛋白相应位点的氨基酸序列相似性。结果成功筛选到DTMUV E蛋白的一个线性抗原表位_(87)YAEYI_(91),该抗原表位在DTMUV中具有高度的保守性,无氨基酸位点差异,而与其他黄病毒E蛋白相应位点的氨基酸序列不具有相似性。Dot-Blotting结果表明表位_(87)YAEYI_(91)与DTMUV阳性血清具有良好的亲和性,而与JEV、DENV、WNV等黄病毒阳性血清间不出现交叉反应,可见抗原表位_(87)YAEYI_(91)为DTMUV所特有的抗原表位。利用DTMUV特异性抗原表位87YAEYI_(91)建立Epitope-ELISA血清学诊断方法并对126份鸭血清样品进行检测,以中和试验作为标准进行比较,结果显示Epitope-ELISA检测方法的相对特异性为100%,相对敏感度为96%,并且Epitope-ELISA与其他黄病毒血清间不出现交叉反应性,表明本研究建立的Epitope-ELISA检测方法是一种特异的、灵敏的ELISA血清学诊断方法。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达与反应原性分析

为了利用原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)E蛋白,试验利用RT-PCR方法扩增DTMUV E基因,经核苷酸序列测定后,与pET-30a(+)载体连接,然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建重组表达载体pET-DTMUV-E,再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达DTMUV E蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物,Western-blot方法鉴定反应原性,分别从诱导时间和IPTG浓度方面对表达条件进行优化,并进行表达产物的可溶性分析。结果表明：克隆得到大小约为1 503 bp的DTMUV E基因,并成功与pET-30a(+)载体连接,获得分子质量约65 ku的融合蛋白,可以与兔抗6×His多克隆抗体和鸡抗DTMUV多克隆抗体发生特异性免疫反应,终浓度为4 mmol/L的IPTG诱导4 h为最佳表达条件,重组蛋白DTMUV E主要以包涵体形式表达。说明利用原核表达系统表达的以包涵体形式存在的DTMUV E蛋白,具有较好的反应原性。     

鸭坦布苏病毒E基因的分子特性分析

为给鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus,DTMUV）囊膜糖蛋白选择良好的抗原域和宿主表达系统提供参考依据,本研究通过选取DTMUV QD株基因文库中的一个重组质粒并测序,结合NCBI的ORF Finder和BLAST工具发现一个全长为1488 bp完整开放阅读框架（Open Reading Frame,ORF）片段。将该ORF编码蛋白通过NCBI的BLASTP分析和DNAstar进化树分析,确定该蛋白与类黄病毒E基因编码的蛋白具有较高的相似性。随后应用生物信息学分析工具Conserved Domains确定保守结构域、运用SignalP4.1预测信号肽、TMHMM 2.0预测跨膜区。应用在线程序NetNGlyc1.0预测糖基化位点,NetPhos2.0预测磷酸化位点、ProtScale进行疏水性分析。最后运用在线EMBOSS和自动蛋白同源建模数据库进行3D结构预测以及密码子偏爱性分析。结果表明,E蛋白与其它黄病毒衣壳蛋白具有相似的功能,没有信号肽切割位点,在451-468和475-492aa区域含有跨膜区,为相对低表达基因,含有较多种类的稀有密码子,与人密码子使用频率较为接近。这为进一步研究DTMUV E基因的体外表达和宿主选择提供了分子生物学依据。     

鸭坦布苏病毒研究进展

2010年以来中国大部分种鸭和蛋鸭养殖地区相继发生了以减料、产蛋下降和伴有一定死淘率为特征的传染病。该病发病急,传播快,死淘率高,给中国的养禽造成巨大的经济损失,仅2010年给中国的养鸭业造成的损失达50亿元。随着研究的深入,该病被确诊为是由一种新型病毒-鸭坦布苏病毒引起的传染病,本文围绕着该病的流行病学、临床症状、病理变化、病毒生物学特性、病毒检测方法及致病力等方面的研究进展进行综述,旨在为鸭坦布苏病的防控提供科学依据。     

鸭坦布苏病毒研究进展

2010年4月以来,我国主要蛋鸭养殖区福建、山东、浙江、上海、江苏等地陆续暴发一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病,造成约1.2亿只蛋鸭和1500万只肉鸭发病,经济损失达数十亿元.根据主要病变和临床特点,曹贞贞等将该病命名为鸭出血性卵巢炎(Duckhemorrhagic ovaritis,DHO)[1].少数学者提出了鸭病毒性脑炎、鸭鹅脑炎-卵巢炎综合征、鸭传染性产蛋减少症等名称[2-4].     

鸭坦布苏病毒山东株的分离鉴定及其特性

采用鸭胚尿囊腔接种、盲传的方法从山东某地区以瘫痪为主要特征的雏鸭脑组织中分离到1株病毒,并对分离病毒的生物学特性和理化特性进行了研究。结果显示,该病毒与OenBank上已发表的坦布苏病毒核苷酸同源性均高于98％,最高可达99．7％;病毒的ELD50为10^-3.17／0．2mL,接种9日龄鸭胚,68h左右鸭胚死亡,胚体出血,肝脏肿大出血,尿囊膜增厚;病毒对胰蛋白酶、酸、氯仿和热敏感,0．5％的胰蛋白酶、pH〈5和4．8％的氯仿条件下可将其灭活,56℃水浴20min或60℃水浴15min可将其灭活,37℃处理24h毒力由10^-3.17／0．2mL下降至10^-1.8／0．2mL;Mg2＋不能提高病毒在50℃60min的稳定性;病毒未经酸碱处理不具有凝集鸡、鸭、鸽等红细胞的特性。接种7日龄雏鸭,48h后陆续发病,表现为病毒性脑炎;剖检变化为雏鸭脑水肿,脑部毛细血管充血、肝脏出血、腺胃出血、肺出血水肿,临床表现与自然发病相同。结果表明,该病毒分离株为坦布苏病毒。     

鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析

【目的】 了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】 通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】 分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】 成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。     

鸭混合感染病例中鸭坦布苏病毒的分离鉴定与E基因序列分析

对山东省滨州某鸭场2013年送检的疑似鸭瘟或鸭坦布苏病毒感染的临床病料,通过PCR检测进一步确诊为鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染,并分离到了鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染毒,为获得单一的鸭坦布苏病毒,利用鸭瘟阳性血清对分离病毒连续进行2次中和试验,接种10日龄SPF胚并连续传3代,收获尿囊液,通过PCR鉴定获得了单一的鸭坦布苏病毒。对分离毒进行ELD50及血凝性等相关测定,并RT-PCR扩增全长E基因,进行序列分析。研究成功得从鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染的病料中分离到鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒的致病机理等基础性研究以及相关疫苗与诊断试剂的研制奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒的研究进展

鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)引起的一种以产蛋鸭产蛋量下降和雏鸭或育成鸭出现神经症状为主要特征的传染性疾病。2010年在我国江浙地区首先暴发,随后迅速波全国主要养鸭省份,给我国的养鸭业造成了极大的经济损失。本文主要从生物学特征、传播途径、流行病学、临床症状、诊断等方面阐述该病毒的最新研究进展,为其相关研究提供参考。     

鸭胚中鸭坦布苏病毒的分离与鉴定

从山东省某种鸭场送检的鸭胚中分离到1株鸭坦布苏病毒(TMUV),命名为SDBZ株。根据Gen Bank上已发表的TMUV NS3基因序列设计一对引物,利用RT-PCR对该分离株NS3基因扩增并测序,将获得的SDBZ株NS3基因与Gen Bank中的11株TMUV及10株其他黄病毒属病毒基因进行对比分析。结果表明,该分离株NS3与Gen Bank上已发表的TMUV-WZDu、SDLY、JS804的同源性可达98.9%,与其他黄病毒属病毒基因同源性较低,为53.7%~77.2%。该研究结果为证明TMUV垂直感染提供了流行病学依据。     

鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备

本试验利用纯化的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus , DTMUV)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,筛选获得3株能够稳定分泌杭DTMUV的杂交瘤细胞,分别命名为:J1-E5-E4, 7B5和1E5-B6,3株杂交瘤细胞诱导同品系刁、鼠的杭体效价为1:12 800,1:6 400和1:25 600。间接ELISA和IFA结果显示,3株单杭均可以与DTMUV发生特异性反应。进一步研究发现,J1-E5-E4可以与DTMUV-E蛋白结合,使得表达E蛋白的293T细胞显现出特异性的绿色荧光;在病毒中和试验中,J1-E5-E4可以中和DTMUV,使其失去致死鸡胚的能力。这些结果表明,J1-E5-E4是一株针对DTMUV-E蛋白中和表位的单杭,该单杭将在DTMUV诊断和杭原分析中发挥重要作用。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鉴定及分析

为了对流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白抗原表位E19进行核心序列定位,本研究设计了一系列编码相互部分重叠短肽核苷酸序列,原核融合表达后经western blot分析,确定其抗原表位核心序列为150ENHGNYS156.该表位在乙型脑炎不同基因型的各种病毒株间为高度保守序列;根据JEV E19表位与同一血清群其他黄病毒之间的差异,在同源序列位置设计了系列突变短肽,融合表达后western blot分析的结果表明,其他黄病毒属病毒同源序列不能与抗JEV阳性血清反应.本实验结果表明JEV E蛋白抗原表位E19具有鉴别检测JEV与西尼罗病毒等其它黄病毒的意义.本实验为进一步研究E蛋白结构和功能以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定了分子生物学基础.     

雏鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因序列分析

山东潍坊地区某鸭场养殖的21日龄樱桃谷鸭突然发病,病鸭主要表现翅腿瘫痪等神经症状,排黄绿色或黄白色稀粪,病死率5%左右。为了确定发病鸭群感染病原的种类,首先采集病死鸭肝脏,处理后接种9日龄~11日龄SPF鸡胚进行病原分离。其次,对分离的病原RT-PCR扩增和序列测定,MEGA5绘制系统发育进化树,DNA Star软件分析核苷酸同源性。结果表明,通过SPF鸡胚分离到一株坦布苏病毒(TMUV),命名为TMUV-SDWF。该病毒株基因组全长为10 990nt,编码1个含3 426个氨基酸的多聚蛋白。系统发育进化树分析显示,TMUV-SDAG毒株属于Ⅰa分支。核苷酸同源性分析表明,TMUV-SDSG与GenBank上公布的16株不同TMUV分离株核苷酸同源性高达97.0%~99.8%。成功分离鉴定一株鸭坦布苏病毒并对其进行了遗传进化分析,为鸭坦布苏病毒弱毒或灭活疫苗的筛选制备及该病毒分子流行病学的研究奠定了基础。