绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种多重PCR检测方法的建立

为同时快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)和山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp),本研究根据Mo的P80基因,Mmc的MLC_1760和Mccp的arcA基因序列,设计合成了3对特异性引物,建立了同时检测Mo、Mmc和Mccp的多重PCR方法。该方法可以同时扩增出Mo、Mmc和Mccp的特异性片段,而对大肠杆菌、巴氏杆菌、羊传染性脓疱病毒等常见羊病病原无交叉反应,对Mo、Mmc和Mccp的最低检出量分别为3.62×10~4拷贝/μL、4.03×10~5拷贝/μL和6.78×10~5拷贝/μL。应用该方法对75份临床样品进行检测,结果与单一PCR检测结果一致。对32份临床样品同时用该多重PCR方法与分离鉴定法进行检测,结果显示,两种方法对Mo、Mmc、Mccp的检测符合率分别为87.5%、100%、100%。本研究建立的多重PCR方法特异性强、敏感性较高,适用于Mo、Mmc和Mccp临床快速检测及流行病学调查。     

牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速检测牛支原体(Mycoplasma bovis)的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank中收录的牛支原体OPPD/F基因序列(登录号:AF130119),利用Primer 5.0软件设计特异性引物与TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,构建检测牛支原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.994,扩增效率E=1.280。荧光定量PCR法检测的敏感性是常规PCR的10倍;特异性良好,检测9种相关细菌和病毒均为阴性;重复性好,组内及组间样本检测Ct值均小于2%。牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法较之于常规PCR方法有快速、特异性强、敏感性高、稳定性好的优点。     

山羊传染性胸膜肺炎荧光定量PCR检测方法的初步建立

为实现山羊传染性胸膜肺炎(CCPP)快速检测,研究基于病原体山羊支原体山羊肺炎亚种的16S rRNA基因,设计合成特异性引物及探针,采用5'FAM-TAMRA3'标记物进行标记.结果显示,试验建立的CCPP-16S实时荧光定量PCR方法可特异性检测CCPP,产生特异性荧光信号,对相关其他病菌无法检出荧光信号;以CCPP...     

应用双重PCR方法检测羊支原体肺炎病原

通过对丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri,Mmc)特异性引物MmcF/MmcR和绵羊肺炎支原体(M.ovipneumontiae,Mo)特异性引物LmF/LmR退火温度、引物浓度比例等条件的选择,建立了一个可以同时检测Mmc和Mo的双重PCR方法。该方法可同时扩增出Mmc 195 bp和Mo 361 bp目的片段,但对其他病原菌不能扩增出任何条带,具有良好的特异性。敏感性试验表明,该方法能够分别检测出0.1ng的Mmc DNA和0.01 ng的Mo DNA,或同时检测出1ng Mmc和1ng Mo混合的DNA。用该双重PCR方法可对实验室保存的4株绵羊肺炎支原体和2株丝状支原体山羊亚种进行准确鉴定,并可从临床病料中检测出相应支原体,表明建立的双重PCR方法可用于Mmc和Mo的快速鉴定、实验室诊断和病原学调查。     

基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原...     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R²=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。     

山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重 PCR 检测方法的建立

为建立一种能够同时检测山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的双重 PCR 方法，本研究采用2对特异性引物，对退火温度和引物浓度比进行了优化，成功建立了一种能同时检测上述两种病原的双重 PCR 方法。结果显示，该方法具有很好的特异性，仅对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌有扩增，而对其他常见的羊呼吸道病原无扩增；该方法对两种病原的检测限分别为32 pg 和50 pg，与单独 PCR相同；26份临床样品中山羊支原体山羊肺炎亚种的检出率为23．1％，多杀性巴氏杆菌的检出率为26．9％。所建立的双重 PCR 具有特异性好、灵敏度高的特点，为临床上这两种病原感染的快速诊断和流行病学调查等提供了更为有用的手段。     

羊丝状支原体簇环介导等温扩增检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了羊丝状支原体簇的快速检测方法,该方法以羊丝状支原体簇成员的保守性基因16S rRNA为靶序列,设计了4条特异性引物,在65 ℃等温条件下,60 min一步完成反应。在反应管中预先添加羟基萘酚蓝(HNB),阳性呈蓝色,阴性呈紫色。丝状支原体簇成员——丝状支原体山羊亚种(Mmc)、丝状支原体丝状亚种LC型(Mmm LC)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的LAMP检测为阳性;对其他病原菌没有交叉反应。以Mmc的核酸为模板进行灵敏度检测,LAMP的最低检出限为10 pg/μL。结果表明,本试验建立了一种特异、敏感、快速、简便的羊丝状支原体簇的LAMP方法。     

Leachii支原体PCR检测方法的建立与应用

为建立一种leachii支原体的检测方法,本研究根据leachii支原体LPPA外膜蛋白编码基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。结果显示,该方法仅对leachii支原体扩增出539 bp的目的片段,而与牛支原体、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、丝状支原体丝状亚种小菌落型、山羊支原体山羊肺炎亚种等其它支原体无交叉反应,具有良好的特异性;该方法对leachii支原体的最低检测浓度为105 ccu/m L,敏感性较高。采用该方法可以在乳汁和关节液等病料样品中检测到leachii支原体,与分离培养的结果相符。上述结果表明,本研究建立的leachii支原体PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可实现准确、高效检测leachii支原体的目的。     

牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以牛支原体p80基因为靶基因,设计特异性引物与探针,优化反应体系,建立了牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan real-time PCR)检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性评估以及临床样本检测。结果显示,特异性试验中,牛支原体2个菌株Cq值均小于18,其余13个非牛支原体菌株Cq值均大于36;敏感性试验中,最低可检3.89拷贝/μL靶DNA,是普通PCR的10~4倍(普通PCR 3.89×10~4拷贝/μL);重复性试验中,组内、组间重复的变异系数均小于1%;44份牛的临床样品利用TaqMan real time PCR检出6份阳性(阳性率为13.64%),分离培养鉴定检出7份阳性,普通PCR检测全部阴性。本研究建立了一种敏感、特异、稳定的牛支原体TaqMan real time PCR检测方法,可用于牛支原体的快速诊断和核酸定量检测。     

羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中的羊口疮病毒基因组(AY386264)ORFVgORF121及ORFVgORF122基因的DNA序列,应用Beacon Designer 7.7软件设计一对引物和一条TaqMan探针,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法组内及组间重复试验变异系数均低于2%,上机检测时间不超过40min,检测灵敏度达1×101copies/μL,山羊痘及禽痘病毒特异性检测均为阴性,标准曲线的相关系数(R2)为0.998 088,线性关系良好。应用该方法对云南保山和普洱送检的羊口疮临床组织病料进行绝对定量检测,送检样品抽提DNA中病毒拷贝数分别为1.35×108copies/μL和9.62×107copies/μL。结果表明,研究建立的羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、稳定、快速和安全的特点,适于羊口疮临床组织样品的早期检测及常规病原监测。     

猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重荧光定量PCR检测方法的建立

建立同时检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体的双重荧光定量PCR方法。根据猪肺炎支原体P97序列和猪鼻支原体P37序列的特异性引物,分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针,建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系,同时检测其敏感性、特异性和重复性。建立的双重荧光定量PCR对猪肺炎支原体和猪鼻支原体的最低检测值均为10copies·μL-1;与猪源致病菌、病毒和其他常见细菌均无交叉反应;各浓度标准品的Ct值变异系数小于5%,重复性好。检测72份临床样本,其中猪肺炎支原体的肺阳性率为80%,鼻拭子阳性率22%,支气管肺泡灌洗液阳性率58.33%;猪鼻支原体的肺阳性率为40%,鼻拭子阳性率66%,支气管肺泡灌洗液阳性率41.67%。建立的双重荧光定量PCR方法比普通PCR更加敏感,实用性强,可用于临床样品的检测。该方法能同时快速和定量地检测猪肺炎支原体和猪鼻支原体,在短时间内获得样品的多个信息,快速地解决了多次检测所需的时间以及经济消耗,为猪肺炎支原体和猪鼻支原体的监测和防控提供了新型、可靠的检测技术。     

鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL～1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。     

山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎混合感染的检测与分析

利用特异性PCR方法从病山羊组织病料中分别扩增山羊痘病毒、羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种特异性片段,继而将扩增的特异性片段克隆、测序,并与GenBank上相应的基因序列进行比对、绘制系统进化树,进行流行病学分析。结果表明,从病山羊中可同时扩增出山羊痘病毒、羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种特异性片段,并通过基因序列比对分析确证了PCR检测结果,首次证实我国存在山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎的混合感染,为我国现阶段羊病的流行病学和有效防制措施的制定提供了参考依据。     

感染Mo对贵州不同品种羊TLRs TRIF通路因子基因转录水平及IFN含量的影响

为了探讨感染绵羊肺炎支原体(Mo)对贵州不同品种羊Toll样受体(TLRs)结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路因子TRIF、TRAF6、IRF3、IRF7基因转录水平及干扰素(IFN)含量的影响,试验选择贵州地区的5个主要品种羊,每个品种随机分为对照组(2只)和感染组(3只),感染组试验羊人工感染Mo,用PCR方法检测不同品种羊感染Mo的情况,采用TaqMan RT-qPCR方法检测不同品种羊血液样本中TLRs TRIF信号通路因子基因转录水平,并用ELISA方法检测不同品种羊血液样本中的IFN含量。结果表明：从各品种羊鼻拭子中均检测出与预期大小相符的特异性条带。与对照组相比,相同品种羊在感染Mo后血液样本中TLRs TRIF信号通路因子基因转录水平均出现不同程度的上升,其中以TRIF、IRF7基因转录水平上调较明显(P<0.05或P<0.01);感染后96小时时贵州白山羊和贵州黑山羊TRIF基因转录水平极显著高于其余3个品种羊(P<0.01);感染后96小时时贵州黑山羊和波尔山羊TRAF6基因转录水平显著高于其余3个品种羊(P<0.05);感染后48,96小时...     

牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV) TaqMan双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的BVDV 5'-UTR基因序列和IBRV gB基因序列,设计了2对特异性引物和2条TaqMan探针。结果显示以含有BVDV 5'-UTR基因和IBRV gB基因的重组质粒为模板绘制的标准曲线,其相关系数(R~2)均大于0.990,线性关系较好。特异性试验结果显示,该方法仅对BVDV和IBRV检测为阳性,而对口蹄疫病毒、牛流行热病毒、牛副流感病毒、牛轮状病毒、牛巴氏杆菌、猪瘟病毒、牛支原体、牛、羊布鲁氏菌检测结果均为阴性,表明其特异性强。该方法的检测下限约为10拷贝/μL,重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2%,利用OIE采纳的BVDV、IBRV荧光定量PCR方法与本实验建立的方法分别对47份牛病料样品进行检测,二者对BVDV和IBRV检测的符合率分别可达97.87%和100%。研究表明所建立的荧光定量PCR方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于BVDV和IBRV的双重定量检测。     

鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量PCR方法的优化

为提高鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan荧光定量PCR方法的敏感性和简化反应条件,本研究在前期建立的TaqMan荧光定量PCR方法的基础上,设计一条特异性的反转录引物,优化反应体系,建立了简便、快速、敏感的TaqMan荧光定量PCR方法。该荧光定量PCR方法最低检测限为10拷贝,敏感性是未优化的荧光定量PCR方法的5倍、是普通PCR方法的100倍,并且该方法对DTMUV的最低检测限是0.01半数鸡胚致死量(ELD50)。通过批内和批间实验的变异系数表明优化的荧光定量PCR方法的重复性比未优化的荧光定量PCR方法好。通过该优化的荧光定量PCR方法检测其它常见的鸭病病毒的DNAs或RNAs,证明了该方法特异性好。对现地60份疑似DTMUV的样品进行检测,用该方法检出57份样品为阳性,明显高于普通PCR,并且在区分35Ct值左右样品试验中敏感性优于未优化的荧光定量PCR方法。该优化的DTMUV TaqMan荧光定量PCR方法更适用于DTMUV的快速定量流行病学诊断。     

饲料及动物性食品中山羊源性和绵羊源性成分双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立一种能同时检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分的双重荧光PCR方法,应用于动物源性饲料及动物性食品的快速检验.方法分别根据山羊、绵羊线粒体种间保守序列,设计合成针对山羊和绵羊的特异性引物及TaqMan探针,通过荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立可同时检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分的双重荧光PCR方法.结果本研究所建立的双重荧光PCR检测方法可同时快速检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分,应用本方法检测山羊肉和绵羊肉模板的检出限均为10-5,与相应的单重荧光PCR方法的检出限一致,比国标法(GB/T20190-2006)的灵敏性高100倍.结论本研究建立的双重荧光PCR检测方法特异性好、敏感性强,适用于饲料、肉制品、乳制品等动物源性食品的快速检测     

Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

羊梅迪-维斯那病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能快速检羊梅迪-维斯那病毒(MVV)的实时荧光定量PCR,根据GenBank中MVV gag基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,经过反应体系及条件优化,以定量的10倍系列稀释的阳性质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增,建立了MVV实时荧光定量PCR。结果显示,该方法对MVV DNA最小检出量为10copies/μL,比普通PCR具有较高的检出率;组内及组间变异系数均低于2%,具有较好的重复性;该方法可以特异地检测到MVV,与其他病毒性样品无交叉反应。被检的92份临床样品中,实时荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为4.3%和3.3%。为羊MVV快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效的方法。