1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

为了解广东猪流感病毒(SIV)的流行变异情况,2010年11月从广东某规模猪场采集流感症状的猪鼻拭子60份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到1株猪流感病毒,通过流感分型RT-PCR和HI试验鉴定为H3N2亚型SIV,命名为A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2),进行全基因序列测定及相似性分析发现,该分离株有低致病性流感分子特征,该毒株的8个基因片段连同最近广东猪群流行的流感毒株与2000年前后H3N2人流感病毒有较高的同源性.系统遗传演化显示,该病毒分离株可能是由1999年人源H3N2流感病毒A/Moscow/10/99(H3N2)进化而来.     

H3N2亚型猪流感病毒HuN株的分离鉴定及其特性研究

正猪流感是猪的一种急性、传染性呼吸系统疾病,猪不分年龄、品种和性别均可以发病。该病虽然在临床上表现为低死亡率,但一旦爆发可在猪群中迅速传播,并降低猪的生产性能及对其他疾病的抵抗能力,使耗料增重比增加,对养猪业造成极大危害,严重威胁我国养猪业的持续稳定发展及畜产品的安全。由于猪呼吸道上皮细胞表面同时含有禽流感病毒和人流感病毒的受体,是流感病毒通过基因重组产生新亚型流感病毒的混合器。因此,对于猪流感病毒的     

H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定及其特性研究

为了对H3N2亚型猪流感病毒进行分离鉴定及特性研究,试验对河北省某猪场具有流感症状的仔猪采用鼻腔棉拭子采样,接种鸡胚分离病毒,经过抗H3、H5、H9单因子血清红细胞凝集抑制试验鉴定为H3N2亚型流感毒株,并对分离毒株的形态学、部分理化特性以及对小鼠的致病性进行研究.结果表明:该毒株血凝素为热不稳定型;对酸、乙醚和氯仿敏...     

H3亚型猪流感病毒分离与鉴定

从东莞和鹤山等地不同猪场采集的40份鼻拭子或病死猪的肺、气管病料中分离到4株有血凝活性的病毒,其中3株病毒与新城疫病毒阳性血清的HI试验为阳性,另外1株病毒与抗猪流感H3亚型猪流感病毒阳性血清的HI试验为阳性;根据猪流感病毒M基因设计引物,扩增出预期的约315 bp片段,表明该病毒为H3亚型猪流感病毒。     

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及小鼠致病性的研究

为了初步了解从江苏某屠宰场分离鉴定出的一株猪源H1N1亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Jiangsu/1070/2019(H1N1)的致病性,对该分离株纯化后进行全基因序列分析,测定其生物学特性,并以10⁶ EID₅₀病毒感染BALB/c小鼠。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点为³³⁹PSIQSR↓G³⁴⁷,符合低致病性SIV的分子特征,与A/Swine/Jiangsu/J006/2018(H1N1)同源性最高达到98.94%,NA基因与A/Swine/Shandong/LY142/2017(H1N1)同源性最高达到98.79%,内部基因PB2、PB1、PA、M、NP和NS分别与2018年出现的不同猪源H1N1亚型具有高同源性,因此该病毒是一株在猪体内重组的病毒;病毒在鸡胚上的半数感染量(EID₅₀)为10^-8.5/0.1 mL,在MDCK细胞上的半数感染量(TCID₅₀)为10^-5.22/0.1...     

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

为调查南京地区猪流感流行情况,本研究于2011年2月～5月期间从南京某屠宰场采集健康猪的鼻拭子和肺脏组织样品共690份,常规无菌处理后进行RT-PCR检测,将检测为阳性的样品接种9日龄～11日龄SPF鸡胚分离猪流感病毒(STV).对分离株进行血凝试验、EID50测定、HA及NA基因测序分析和感染小鼠及猪体试验.结果有18份样品RT-PCR显示为SIV阳性,但只有一株可在SPF鸡胚中稳定增殖.该病毒分离株具有凝集0.5％鸡红细胞的活性,EID50为10-6.32/0.1 mL,基因测序显示其HA、NA基因片段均与09年H1N1型流感流行株A/California/04/2009 (H1N1)高度同源,将其命名为A/Swine/Nanjing/50/2011 (H1N1).小鼠人工感染试验表明该分离株可引起小鼠死亡(3/10),猪体人工感染实验显示该分离株还能够引发猪体明显的流感症状及肺部病变.该病毒的分离鉴定及HA、NA基因序列分析为进一步调查SIV的流行规律提供了基础数据.     

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与进化分析

为探究猪流感病毒（SIV）的流行情况,本实验室2020年11月从广州市某养殖场采集病猪鼻拭子30份,将鼻拭子接种9日龄SPF鸡胚,增殖后分离到1株具有凝血特性的病毒,经特异性PCR鉴定为流感病毒,通过进一步测序发现该病毒为H1N1亚型,命名为A/swine/Neimeng/03/2020 （H1N1）。通过NCBI进行各基因片段的同源性比对,发现该病毒的基因与2000年左右的人H1N1亚型病毒同源性较高。通过构建系统遗传进化树发现,确认病毒株是由人流感病毒A/Dunedin/2/2000 （H1N1）演化而来。通过HA基因推导发现该病毒HA1蛋白与2009年墨西哥流感的流行毒株以及经典的H1N1毒株具有较大的抗原性差异,该病毒呈现较低的致病性,与其HA裂解位点基序（PSIQSRGLF）表现一致,呈低致病性特征。     

山东猪流感病毒H9N2亚型毒株的分离鉴定

近年来春秋和冬季在山东各地猪场不断出现疑似猪流感的呼吸道疾病 ,2002年10月到2003年2月 ,我们从山东发病猪场采集发病猪的鼻咽棉拭子和死亡猪的肺脏 ,接种SPF鸡胚 ,获得血凝性稳定且血凝价较高的尿囊液样品58份 ,对其中10个样品的亚型进行鉴定 ,并将具有代表性的一株病毒的血凝素全基因及其它基因进行了测序与分析。1检测与鉴定方法1.1SPF鸡胚、小白鼠分别由山东齐鲁制药厂和泰安生物制品厂提供。1.2疑似猪流感病猪样品的采集2002年10月 -2003年2月 ,从山东的济宁、宁阳、莘县、邹城、莱芜、梁山、莒南等地对疑似猪流感病例进行诊断 ,…     

H3N2亚型猪流感病毒中国分离株的克隆纯化及生物学特性

以有限稀释克隆法对29株H3N2亚型猪流感病毒(SIV)不同地区分离株进行纯化，并对其生物学特性进行了研究。结果，8株对鸡呈现中等致病力，21株对鸡呈现低致病力。不同地区SIV分离株(第5代)的EID50差异较大，以安徽分离株最高，为10^-10.77／0．2mL，其他毒株在10^-5.5～10^-10.56／0．2mL之间。黑龙江省分离株和浙江省分离株的LD50高达10^-2.84／0．1mL，其他分离株在10^-1.17～10^-2.56／0．1mL之间。经鸡胚分离传代后，SIV分离株均能凝集0．7％人“O”型血、绵羊、兔、豚鼠、小鼠、大鼠及鸡的红细胞，其红细胞凝集谱的差异主要表现在对马、牛、驴、猪红细胞的凝集特性上。大部分SIV分离株为热不稳定型，部分毒株表现为中等热稳定型和热稳定型。从其抗原特性看，大部分SIV分离株表现为亲和相，对AIV参考毒株DKUK63和SIV参考毒株SWTN77表现出较高的HI滴度；部分分离株经鸡胚传代后，出现了相别的变异。     

一株H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定

从北京市延庆区某疑似发生犬流感的德国牧羊犬采集犬鼻拭子,采用鸡胚接种、传代、HI试验、HA和NA基因扩增和序列同源性分析及比格犬回归试验等方法对病毒进行分离鉴定。结果表明,分离的病毒具有HA活性,且HA活性可被H3亚型禽流感病毒阳性血清所抑制(HI抗体效价为1∶160),与H1、H5、H7亚型禽流感病毒阳性血清和犬流感阴性血清HI试验均为阴性反应(HI抗体效价1∶10)。分离病毒HA基因、NA基因与A/canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)毒株HA、NA基因的同源性均为99.8%。攻毒后第4天开始,2只犬均出现体温升高、咳嗽、流鼻和精神沉郁等临床症状,并从鼻拭子中分离到病毒,该病毒是一株H3N2亚型的犬流感病毒,将其命名为A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2)。     

H3N2亚型猪流感病毒重庆株的分离、鉴定、基因组测定及序列分析

从猪流感疑似病例中分离鉴定猪流感病毒,并对病毒进行全基因组测序及其序列的分析。采用鼻棉拭子法从猪流感疑似病猪的鼻中收集病样,制成病毒悬液,经SPF鸡胚增殖培养和纯化。采用红细胞凝集、血凝抑制和神经氨酸酶抑制试验进行病毒亚型的判定,并作电镜观察。运用RT-PCR法扩增病毒的8个基因片段,分别克隆到pMD18-T载体,进行全基因组测序及序列分析。结果表明,获得1株猪流感病毒,经血凝、血凝抑制和神经氨酸酶抑制试验,判定为H3N2亚型,命名为A/swine/Chongqing/CQ/3/2011(H3N2),简称SIV CQ3。基因组序列比较分析显示,SIV CQ3 8个节段与不同时间的猪流感广东分离株(H3N2亚型)相应基因的核苷酸相似性最高,可能来源于H3N2亚型SIV。然而NP、HA和NA基因编码氨基酸序列与参考毒株A/New York/392/2004(H3N2)的相似性比较低,分别达95%、89%和90%;而血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-E-K-Q-T-R↓G,与参考毒株的一致,不具有高致病分子特征。此外,HA和NA的糖基化位点、受体结合位点处氨基酸存在一定程度的差异。最后,系统进化树分析显示NP、HA基因位于SIV群,与A/swine/Guangdong/2006/(H3N2)处于同一分支;而NA基因与禽流感(A/duck/Ontario/2000/AJ697881)和猪流感位于同一个进化单元,表明这株H3N2亚型流感病毒在不断的发生演变。     

猪流感病毒H3N2亚型的分离鉴定与全基因组序列测定

通过鸡胚接种、MDCK细胞培养、血凝及血凝抑制试验、RT-PCR等方法,笔者在四川首次分离并鉴定了1株既能在鸡胚上稳定传代又能在MDCK细胞上稳定产生CPE的H3N2亚型猪流感病毒,命名为A／swine／Sichuan／01／2006（H3N2）;NS基因的测序结果表明：该病毒分离株与A／swine／HongKong／4361／99（H3N2）、A／NewYork／429／2003（H3N2）、A／Queensland／6／2000（H3N2）、A／New South Wales／4／1999（H3N2）等具有代表性的标准毒株的同源性都达到99％;从MDCK细胞中抽提流感病毒基因组进行全基因克隆,构建了11个包含全基因8个基因片段的文库。全基因测序结果表明,A／swine／Siehuan／01／2006（H3N2）共8个节段,全基因序列共计13577bp;基于HA、NA推导蛋白的无根进化树结果显示,四川分离株与人流感标准株A／Queensland／6／2000（H3N2）、A／South Australia／81／2000（H3N2）有较近的亲缘关系,而与猪流感标准株A／swine／Spain／42386／2002（H3N2）的亲缘关系较远。     

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解广东地区猪流感的流行和变异情况,本研究于2013年11月~12月从广东省5个猪场中采集疑似流感症状的猪鼻拭子115份,接种10日龄SPF鸡胚,分离得到一株猪流感病毒(SIV),对其进行血凝和血凝抑制试验、RT-PCR检测及全基因测序分析,结果表明该分离株为H1N1亚型,将其命名为A/Swine/Guangdong/L2/2013(H1N1)。HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR↓GL,具有典型的低致病性流感病毒特征。系统遗传进化分析显示,该病毒与A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1)亲缘关系密切。小鼠的致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠,导致小鼠轻微临床症状和肺脏组织病理学变化,但未在其他组织器官中分离到病毒,并且对小鼠无致死性,为低致病性SIV。该病毒的分离鉴定为广东地区SIV的流行特点和变异情况提供实验依据。     

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离与鉴定及部分生物学特性的研究

本研究从广西某规模化猪场临床病猪肺脏组织中分离到一株猪流感病毒,并对该毒株进行了亚型鉴定和部分生物学特性的研究.结果显示分离到的猪流感病毒为H1N1亚型,HA效价最高达到27.对该毒株分别进行耐热性实验、耐酸性实验、乙醚和氯仿敏感性试验,发现该毒株对热不稳定,并对酸、乙醚和氯仿均敏感,说明该毒株对自然的抵抗力较差.     

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析

本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2).该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7 ％～98.1％、94.4 ％～99.5％和88.6 ％～97.6％;与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7％～98.5％、82.5 ％～99.9％和87.6 ％～98.4％;M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1％以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6％以上.基因型分析表明分离株的PB2、PBI、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒“混合器”的作用.     

抗H3N2亚型猪流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

采用纯化的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)尿囊液作为免疫原免疫6～8周龄Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法筛选分泌抗SIV-H3N2的阳性细胞株,经克隆获得7株亲和力较高的杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2C5、2F10、3D3、4E8、5C7、5D12,用其制备的腹水ELISA效价可达1×106。通过抗体亚型测定,间接免疫荧光试验及免疫印迹试验分析鉴定,该7株单抗均为抗H3N2亚型SIV的特异性单克隆抗体,而且与其他亚型猪流感病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒等均无交叉反应,为H3N2亚型SIV的鉴别诊断奠定了基础。     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒的分离鉴定

在广东进行流行病学调查时从鹦鹉采集的拭子样本中分离到一株禽流感病毒,应用聚合酶链反应(PCR)、血凝抑制试验(HI)和基因测序等方法技术对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且被H5亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制;分别用针对禽流感病毒的M、H5亚型禽流感病毒的HA基因、N2亚型禽流感病毒的NA基因特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,均扩增出特异性目的片段;测序及BLAST分析表明其与H5N2亚型禽流感美国分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性高达97%以上,由此该分离株鉴定为H5N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Parrot/Guangdong/268/2005。     

两株H3N2亚型猪流感病毒的遗传进化及分子特征分析

为对2012年广州规模化养猪场疑似流感病料中分离鉴定的2株猪流感病毒A/swine/Guangdong/1519/2012(H3N2)(简称GD1519)和A/swine/Guangdong/1520/2012(H3N2)(简称GD1520)进行遗传进化及分子特征分析,对两株病毒进行了全基因组的测序分析。通过对其8个基因片段的基因来源进行分析,构建系统进化树,遗传进化分析结果显示GD1519 HA、PB2、PA和NP基因片段均来源于近期人源H3N2亚型Moscow/99-like亚分支;其NA和PB1基因片段来源于早期人源H3N2亚型Victoria/75-like亚分支;其M和NS基因片段来源于近期人源H3N2亚型New York/99-like亚分支。GD1520病毒的HA基因片段来源于近期人源H3N2亚型Moscow/99-like亚分支;其NA和PB1基因来源于近期人源H3N2亚型New York/99-like亚分支;其PB2、PA、NP、M和NS基因片段均来源于早期人源H3N2亚型Victoria/75-like亚分支。分析结果暗示2株病毒可能均由不同时期的类人源H3N2亚型流感病毒间基因重排而产生的新型H3N2亚型猪流感病毒。本研究结果进一步证明猪可能是不同来源流感病毒的基因"混合器",开展猪流感病毒相关分子流行病学研究具有重要的公共卫生意义。