脐带间充质干细胞通过类胰岛素样生长因子-Ⅰ介导的Janus激酶/信号转导及转录活化因子信号通路抑制奶牛乳腺上皮细胞凋亡的体外研究

本试验旨在探究Janus激酶/信号转导及转录活化因子(JAK/STAT)信号通路是否参与脐带间充质干细胞(UC-MSCs)通过类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)抑制奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)凋亡的调节。将UC-MSCs和BMECs利用TranswellTM小室双层共培养,以BMECs单纯培养为对照,给予类胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)抑制剂AG1024进行干预,并用信号阻断剂AG490处理细胞,24 h后采用实时荧光定量PCR检测各组细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)基因的相对表达丰度,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明:UC-MSCs和BMECs共培养组BMECs的凋亡率极显著低于其他各组(P0.01);UC-MSCs和BMECs共培养组Bcl-2基因的相对表达丰度较BMECs组极显著上调(P0.01),Caspase-3、Bax基因的相对表达丰度则显著或极显著下调(P0.05或P0.01);AG1024和AG490单独处理或二者共同处理升高了单独培养的BMECs和与UC-MSCs共培养的BMECs的凋亡率,并上调了Bax、Caspase-3基因的相对表达丰度,下调了Bcl-2基因的相对表达丰度,均具有统计学意义(P0.05或P0.01)。由此得出,UC-MSCs能够通过IGF-Ⅰ介导JAK/STAT信号通路调节BMECs凋亡相关基因的表达,降低BMECs的凋亡率。     

与脐带间充质干细胞共培养对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成及关键基因表达的影响

探究与脐带间充质干细胞共培养对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂合成及关键基因表达的影响。将脐带间充质干细胞和乳腺上皮细胞利用Transwell小室双层共培养,BMECs单纯培养为对照组,IGF-ⅠR抑制剂AG1024处理细胞,检测上清IGF-Ⅰ、甘油三酯(TAG)含量变化,再用磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)信号阻断剂LY294002孵育细胞,RT-qPCR检测乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、脂肪酸合成酶(FASN)和固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element.binding proteins,SREBP1)基因的相对表达丰度。结果显示,共培养后BMECs的IGF-I含量极显著升高(P0.01),TAG含量显著升高(P0.05);加入AG1024后,IGF-I明显受到抑制(P0.01),显著降低了各组TAG含量及各基因的表达丰度(P0.05);LY294002抑制了PI3K(P0.01)、AKT、mTOR(P0.05)mRNA的表达,显著降低了TAG含量及ACACA、FASN、SREBP1mRNA的表达(P0.05);共同处理后极显著降低了TAG合成量及各基因相对表达丰度(P0.01)。结果表明,脐带间充质干细胞能够通过IGF-Ⅰ介导PI3K/Akt/mTOR信号通路上调BMECs乳脂合成关键基因的表达丰度,促进TAG的合成。     

PRV感染三叉神经节细胞对PI3K/Akt信号通路的影响及其调控凋亡

以小鼠三叉神经节(TG)原代细胞为基础,应用实时荧光定量PCR(q-PCR)、Western blot等方法检测伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)(MOI=1)感染TG细胞后不同时间点PI3K、Akt基因的转录水平和蛋白表达情况.PRV感染TG细胞后,利用PI3K特异性抑制剂LY294002处...     

mTOR对信号通路调控的研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路是最近新出现的细胞内重要信号途径,该途径在进化上高度保守,主要通过PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化激活来调控细胞分裂、促进转录、信号翻译等,从而控制蛋白合成来调节细胞生长。mTOR作为一种重要的调节基因通过调节细胞周期、蛋白质合成、细胞能量代谢等多种途径发挥重要的生理功能,在细胞增殖、生长、分化过程中起着中心调控点的作用。     

羊传染性脓疱病毒通过激活PI3K/Akt通路抑制HeLa细胞凋亡

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信号通路是参与细胞增殖、分化和凋亡调控的重要通路之一,多种病毒可通过对该通路的调控而实现对宿主细胞的感染.作为一种重要的人兽共患传染病病原,羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)被证实能够诱导PI3K/Akt通路的活化.利用PI3K特异性抑制剂LY294002靶向抑制PI...     

整合素通过PI3K/Akt信号通路调控畜禽骨骼健康的研究进展

骨骼是脊椎动物中坚硬的结缔组织,具有构成机体基本支架、保护脏器、支撑体重和维持运动的作用。骨骼发育主要是通过膜内成骨和软骨内骨化完成的,该过程由多种调控因子组成的复杂调控网络共同发挥作用以维持畜禽骨骼健康。整合素（integrin）是细胞膜上的一种介导细胞-基质相互作用的跨膜受体,不仅具有引起细胞黏附的作用,还能够通过双向传递细胞内外的信号引发机体相应反应。整合素能够调控多条信号通路,包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路,在维持畜禽动物骨骼健康方面发挥重要作用。PI3K/Akt信号通路是由酶联受体介导的能够调节细胞生命活动的信号通路,能通过炎症、自噬、凋亡等作用调节软骨代谢平衡,对维持骨骼健康具有重要意义。综合国内外关于畜禽骨代谢、整合素和PI3K/Akt信号通路之间关系的研究进展,从整合素对畜禽骨代谢的影响、PI3K/Akt信号通路对畜禽骨代谢的影响以及整合素通过PI3K/Akt信号通路对骨代谢的影响三方面进行综述,以期为探究整合素通过PI3K/Akt信号通路在畜...     

PI3K/Akt信号通路对卵泡发育和卵母细胞成熟作用的研究进展

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是生物体内生长发育过程中的重要信号通路,该通路由多种效应因子组成,在细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、DNA修复和蛋白质合成过程中起关键作用.本文综述了PI3K/Akt信号通路在卵泡发育和卵母细胞成熟方面的研究进展,为相关研究提供理论依据.     

黄芪影响缺氧微环境中骨髓间充质干细胞增殖活性的PI3K-AKT信号通路分析

基于PI3K/AKT信号通路研究黄芪对缺氧环境中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)成骨分化的细胞活性的影响。分别以黄芪冻干粉溶液低、中、高剂量(100、200和300μg·mL^-1)干预低氧浓度(10%)环境中成骨分化培养的BMSCs,通过高内涵实时成像系统观察BMSCs动态增殖情况及分化代数;进行无标记示踪模拟细胞运动轨迹,分析各组细胞运动速度、位移距离和路程的情况;通过激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位,通过免疫荧光和RT-PCR检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白和基因表达水平的变化。结果显示：与对照组相比,10%低氧浓度条件下BMSCs增殖减慢、分化代数减少,运动速度减慢,位移距离和路程减少,线粒体膜电位活性降低,p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PI3K和AKT基因表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与低氧组相比,黄芪冻干粉溶液干预后,能显著维持缺氧环境中BMSCs增殖和分化活性,运动活力升高,线粒体膜电位活性提高,p-JAK2、p-STAT3蛋白和PI3K、AK...     

小G蛋白Ran对奶牛乳腺上皮细胞mTOR和Jak2/Stat5信号通路的影响

为探讨小G蛋白Ran对β-酪蛋白合成的主要信号通路mTOR和Jak2/Stat5及其增殖的影响,本研究对Ran进行瞬时转染和稳定转染,Western blot检测细胞中mTOR、p-mTOR、Stat5和p-Stat5的表达;高压液相层析仪检测酪蛋白的分泌量;CASY细胞活力分析仪分析细胞活力。结果显示,Ran过表达时,细胞活力显著增加(P0.01),细胞中mTOR、p-mTOR、Stat5和p-Stat5的表达均也显著增加(P0.01);表明Ran可能激活细胞中的mTOR通路和Jak2/Stat5通路,对乳腺上皮细胞的泌乳与增殖有正向调节作用。     

茶黄素通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路促进小鼠乳腺肿瘤细胞凋亡

本试验旨在研究茶黄素促进小鼠乳腺肿瘤细胞凋亡的作用机制。采用不同浓度[0(A组)、48(B组)、88(C组)、128μmol/L(D组)]茶黄素处理小鼠乳腺肿瘤细胞(C-127细胞)24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜检测细胞活性与坏死情况,透射电镜观察细胞形态,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测半胱氨酸特异性天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA相对表达量,Western Blot法检测活化后的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、PI3K、Akt、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果显示：1)与A组相比,B组细胞存活率显著降低(P<0.05),C组、D组细胞存活率极显著降低(P<0.01)。2)与A组相比,B组、C组、D组细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。3)与A组相比,B组Akt的mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01),PI3K、Bcl-2的mRN...     

体外诱导牛骨髓间充质干细胞向乳腺样上皮细胞分化的初步研究

为培育转基因肉牛提供种子细胞及进一步丰富牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)的多向分化潜能,本试验利用细胞免疫荧光染色方法和分子生物学方法初步探讨在表皮生长因子、胰岛素、催产素和孕酮等条件下,体外诱导牛BMSC向乳腺样上皮细胞分化的可能性。利用不同浓度的诱导液对纯化稳定的P4、P8和P12代牛BMSC进行体外诱导,并对诱导后的细胞进行细胞免疫荧光观察和RT-PCR鉴定。结果显示,诱导后部分BMSC细胞呈多角形,而不再呈明显的梭形和纺锤形,经细胞角蛋白18免疫荧光染色后出现明显的荧光。P4代牛BMSC在诱导液Ⅱ的诱导作用下分化效果显著。RT-PCR结果显示,诱导分化后细胞角蛋白19基因、β-酪蛋白基因及αs1-酪蛋白基因在细胞中表达。因此,在体外,多因子联合诱导可使牛BMSC初步分化为乳腺样上皮细胞并且在诱导液Ⅱ的联合诱导下分化作用最明显。     

基于AMPK信号通路研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞脂代谢的调控机理

为了探讨脂多糖(LPS)对乳腺健康及乳脂合成的调控机制,本试验以奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)为模型,通过向细胞中添加不同浓度的LPS (0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL、10000 ng/mL),分别检测其细胞存活率、炎症因子、甘油三酯(TG)含量、腺苷酸活...     

雌激素调控奶牛乳腺上皮细胞凋亡及生长周期作用机制的研究

试验旨在研究雌激素对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）凋亡及生长周期的影响。通过添加MAPK/ERK信号通路阻断剂探索雌激素调控BMECs凋亡及生长周期具体的作用机制,采用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化情况,实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Caspase3及CyclinD1基因mRNA的表达丰度。结果显示,对照组BMECs凋亡率极显著低于BMECs+PD98059、BMECs+E₂+PD98059组（P<0.01）,Bcl-2 mRNA表达丰度极显著高于BMECs+PD98059组（P<0.01）,Caspase3 mRNA表达丰度显著低于BMECs+PD98059组（P<0.05）;对照组细胞比例在G1期显著高于BMECs+E₂组（P<0.05）,极显著低于BMECs+E₂+PD98059组（P<0.01）,S期细胞比例极显著高于BMECs+PD98059、BMECs+E₂+PD98059组（P<0.01）,G2期细胞比例极显著低于BMECs+PD98059、BMECs+E₂+PD98059组（P<0.01）;对照组CyclinD1 mRNA的表达丰度极显著高于BMECs+PD98059组（P<0.01）;BMECs+E₂+PD98059组的Bcl-2 mRNA的表达量极显著高于BMECs+PD98059组（P<0.01）,Caspase3 mRNA的表达量显著低于BMECs+PD98059组（P<0.05）。结果表明,MAPK/ERK信号通路参与BMECs的增殖及细胞生长周期调节的过程,且雌激素可通过MAPK/ERK信号通路抑制BMECs的凋亡,MAPK/ERK信号通路可能参与由雌激素调控的细胞生长周期的进程。     

JSRV Env通过Akt/mTOR信号通路调控绵羊绒毛膜滋养层细胞增殖

利用已构建的JSRV Env慢病毒载体转染绵羊绒毛膜滋养层细胞(STCs),探讨Akt/mTOR信号通路的激活及其对细胞增殖的影响.以STCs为空白组,空病毒载体转染STCs为对照组,JSRV Env慢病毒载体转染STCs为试验组,通过Western blot检测Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白的表达,并...     

奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响

【目的】探讨奶牛脂肪间充质干细胞(bovine adipose-derived mesenchymal stem cells, bAD-MSCs)对氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力的影响。【方法】使用0、5、25、50、100、200μmol/L H₂O₂处理奶牛子宫内膜上皮细胞2、4、6、8、12 h后,通过MTT试验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平来筛选H₂O₂诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的最佳条件。在细胞划痕试验中设立对照组、H₂O₂组、bAD-MSCs共培养组(1∶0.5)、bAD-MSCs共培养组(1∶1)、奶牛乳腺上皮细胞(MACT)共培养组(1∶0.5)和MACT共培养组(1∶1)共6组,分析奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力,并利用Western blotting检测细胞外蛋白调节激酶(Erk)和磷酸化细胞外蛋白调节激酶(pErk)蛋白的表达水平。【结果】MTT试验结果显示,4～12 h内50μmol/L...     

小鼠MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞为成肌细胞的研究

为了探讨小鼠MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）为成肌细胞的可能性,本研究用小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表达载体质粒转染绵羊UCMSCs,在观察细胞形态变化的同时,检测成肌细胞标记蛋白表达、表达成肌细胞特异蛋白的细胞比率和成肌细胞特异基因mRNA相对表达量。结果显示,与对照组（未转染）相比,在转染MyoD-pcDNA3.1质粒后第21天,大部分细胞呈现似成肌细胞的细长管状;与对照组未表达相关蛋白相比,转染MyoD-pcDNA3.1后第8天,在荧光倒置显微镜下观察到细胞表达MyoD和Desmin蛋白荧光,转染后第16天,不仅观察到细胞表达MyoD和Desmin,而且观察到MyoG蛋白的表达;对于转染细胞后22 d的细胞进行流式细胞仪检测显示,表达MyoD、MyoG和Desmin的细胞比率分别达93.5%、97.4%和99.5%;此外,实时荧光定量PCR检测显示,转染MyoD-pcDNA3.1后第28天,其细胞中的MyoD、MyoG和Desmin mRNA相对表达量分别提高2.046、2.389和5.489倍。上述结果表明,利用小鼠MyoD构建真核表达载体具有诱导UCMSCs分化为成肌细胞的功效。     

JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路介导小反刍兽疫病毒宿主细胞天然免疫的研究

为研究JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路在小反刍兽疫病毒（PPRV）宿主细胞天然免疫中的作用,在PPRV感染山羊肾细胞24、48和72 h后,分别用MTT试验和间接免疫荧光试验（IFA）检测病毒感染细胞活力及其在细胞中的分布;用qRT-PCR和Western-blot分别检测病毒蛋白、Nectin-4受体、 JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路及其下游信号分子表达水平的变化。结果表明,PPRV感染24、48和72 h后的细胞存活率分别为99.53%、77.12%和66.87%,病毒H和N蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;但Nectin-4表达无显著变化（P>0.05）;p-STAT1/STAT1比值极显著升高（P<0.01）;ISG20、ISG15、IRF9、IRF3、IFNβ和IFNα表达水平显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01）;p-AKT表达水平极显著升高（P<0.01）;p-AKT/AKT、p-NFκB/NFκB、p-GSK/GSK和p-CREB/CREB比值均显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01...     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

移植脐带间充质干细胞对荷斯坦公犊日增重及血清生长因子水平的影响

本试验旨在研究移植脐带间充质干细胞对荷斯坦公犊日增重及血清生长因子水平的影响.选取1月龄体重相近的荷斯坦公犊28头,随机分为对照组和试验组,采集健康的荷斯坦新生胎牛的脐带组织,通过胰酶消化筛选法体外分离、纯化及培养牛脐带间充质干细胞(UC-MSCs),试验组按公犊体重(3×10⁵个/kg干细胞)稀释至8 mL颈静脉注射至体内,对照组注射等量生理盐水.试验期154 d.结果表明,注射UC-MSCs后,试验组公犊平均体重在4、5、6月龄时显著高于对照组(P< 0.05);试验组公犊平均日增重在3、4月龄时显著高于对照组(P< 0.05),而在6月龄时极显著高于对照组(P< 0.01).试验组血清中类胰岛素样生长因子(IGF-1)水平在4月龄时显著高于对照组(P< 0.05);试验组血清中血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-α)水平在3月龄时显著高于对照组(P< 0.05);试验组血清中VEGF、成纤维细胞生长因子(bFGF)、TGF-α水平在6月龄时显著或极显著高于对照组(P< 0.05;P< 0.01);2、3、4、6月龄时,试验组血清中骨形态发生蛋白(BMP-7)水平显著低于对照组(P< 0.05).综上所述,移植UC-MSCs能显著提高公犊的平均日增重及血清中IGF-1、VEGF、TGF-α、bFGF水平,血清中这些生长因子与公犊的生长发育密切相关,进而影响其生长性能.