细毛羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5p靶基因预测及验证

为了探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,以细毛羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因FGF_2进行核酸水平相对定量检测,利用Western Blot对潜在靶基因FGF_2进行蛋白相对定量检测。生物信息学预测结果表明,FGF_2的3'UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点;miR-1298-5p在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达;miR-1298-5p与其潜在靶基因之间呈现一种负调控趋势,说明miR-1298-5p可能通过负调控FGF_2从而调控皮肤毛囊生长发育。表明结合靶基因预测结果、miR-1298-5p在核酸水平表达规律及FGF_2在核酸水平表达规律和蛋白表达水平表达规律初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。     

绒山羊皮肤毛囊miR-1298-5P靶基因预测及表达载体构建

探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5P的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为miR-1298-5P与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论依据。以辽宁绒山羊皮肤毛囊组织为材料,通过miRNA的分离、表达、靶基因预测筛选表达及靶位点3'UTR表达载体构建,采用RT-PCR进行表达检测,用生物信息学方法预测miR-1298-5P的靶基因,并对其靶基因Fg F2的靶位点进行克隆测序、缺失突变。miR-1298-5P及其靶基因在皮肤毛囊不同发育时期均呈现差异性表达,二者之间呈现一种负调控趋势,其可能对皮肤毛囊周期性发育起到一定的调控作用。靶基因预测发现Fg F2的3'UTR存在mi R-1298-5P种子区结合位点,并成功构建了Fg F2 3'UTR表达载体,该载体的成功构建为后期过表达转染体系的建立和功能基因的验证奠定了基础。     

辽宁绒山羊皮肤毛囊miR-1298-5p靶基因预测及验证

以辽宁绒山羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,用生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RTPCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因TGF-βR1进行核酸水平表达检测,利用Weston blot对潜在靶基因TGF-βR1进行蛋白水平表达检测。生物信息学预测结果表明TGF-βR1的3′UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点;miR-1298-5p在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达;TGF-βR1在皮肤毛囊不同发育时期无论在核酸水平还是蛋白水平均呈现差异性表达;miR-1298-5p与其潜在靶基因之间呈现一种负调控趋势,说明miR-1298-5p可能通过负调控TGF-βR1,从而对毛囊周期性发育起到调节作用。结合靶基因预测结果、miR-1298-5p在核酸水平表达规律及TGFβR1在核酸水平表达规律和蛋白水平表达规律初步确定TGF-βR1为miR-1298-5p的靶基因。本实验旨在探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5p与其靶基因的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为miR-1298-5p与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论研究数据。     

猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证

为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区(3′UTR)片段,构建E2F3的野生型(E2F3-3′UTR-wt)和突变型(E2F3-3′UTR-mut)双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性(P0.05)。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建成功,且其与miR-10a-5p之间存在靶向关系。     

兔microRNA-18b生物信息学分析及其与CDK19的靶向验证

为探究miR-18b对兔卵巢颗粒细胞增殖凋亡的作用及潜在调控靶点,利用生物信息学技术预测兔miRNA-18b(ocu-miR-18b)的靶基因及其可能参与的生物学过程。预测结果发现靶基因的功能注释分析显著富集在细胞增殖和凋亡的调控等过程,而其中CDK19可能是miR-18b的潜在靶基因。为验证假设,将扩增的野生型及突变型的CDK19 3'UTR序列分别克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-18b的mimics(试验组)或mimics NC(对照组)共同转染至HEK293T细胞。通过双荧光素酶报告系统检测细胞的荧光素酶活性,鉴定miR-18b与CDK19 3'UTR的靶向关系。并且通过qRT-PCR检测miR-18b对靶基因的调控作用。结果表明:成功构建了CDK19基因3'UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-18b可以作用于CDK19基因3'UTR,抑制其荧光素酶活性。此外,qRT-PCR分析表明,miR-18b与CDK19表达模式相反。从而证明了miR-18b与CDK19的直接靶向关系,为更深入研究miR-18b与卵巢颗粒细胞的关系奠定基础。     

绵羊INHBB、SMAD4和FGF18基因的双荧光素酶载体构建及其与miR-370-3p的靶向验证

为研究绵羊输卵管功能相关的oar-miR-370-3p与抑制素亚基βB （inhibin subunit beta B,INHBB）、SMAD家族成员4（SMAD family member 4,SMAD4）和成纤维细胞生长因子18（fibroblast growth factor 18,FGF18）基因之间的靶向关系,本研究对多个物种（绵羊、人、小鼠、大鼠、猕猴、豚鼠和兔）中miR-370-3p的序列进行了比对,利用RNAhybrid程序预测绵羊miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR可能存在的结合位点,随后分别构建INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。结果表明,绵羊miR-370-3p序列与其他6个物种不同,但具有一定的保守性。RNAhybrid程序预测到oar-miR-370-3p与INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR存在结合位点。PCR扩增结果和测序结果表明,INHBB、SMAD4和FGF18基因3'UTR的野生型和突变型载体构建成功。共转染INHBB、SMAD4和FGF18野生型载体和miR-370-3p mimics的双荧光素酶活性极显著或显著低于相应的对照组（P<0.01;P<0.05）;而3种突变型载体和miR-370-3p mimics共转染的双荧光素酶活性均与相应的对照组无显著差异（P>0.05）。表明INHBB、SMAD4和FGF18基因的3'UTR区域均能与miR-370-3p结合并抑制双荧光素酶活性,验证了INHBB、SMAD4和FGF18基因均是miR-370-3p的靶基因,为进一步研究oar-miR-370-3p影响绵羊输卵管功能与绵羊繁殖力的分子机制提供依据。     

肉牛DKK3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒构建及与miR-25的靶向验证

实验旨在鉴定miR-25与肉牛DKK3基因之间的靶向关系，为开展miR-25调控肉牛肌内脂肪生成的分子机制研究奠定基础。利用生物信息学分析软件TargetScan预测miR-25的潜在靶基因及结合位点，然后PCR扩增包含miR-25结合位点的肉牛DKK3基因3’非编码区（3’UTR）片段，构建DKK33’UTR野生型、突变型及删除型双荧光素酶报告基因质粒，并分别与miR-25 mimics和mimics NC共转染牛肾细胞（MDBK），检测双荧光素酶活性；此外，miR-25 mimics、mimics NC、miR-25 inhibitor、inhibitor NC分别转染MDBK细胞，荧光定量PCR和Western blot检测DKK3表达量。结果表明：TargetScan软件预测到miR-25具有包括DKK3在内的共944个潜在靶基因，且与DKK3结合的靶位点位于DKK3基因3’UTR的25～32 bp处；构建的3种质粒经双酶切后释放出大小约321 bp的条带，测序结果与预期一致，表明质粒构建成功；miR-25mimics可显著降低DKK3野生型质粒的双荧光素酶活性；过表达miR-...     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

猪VEGFA 3′UTR生物信息学分析及其与miR-361-5p的靶向验证

为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

猪miR-135a-5p预测靶基因APC的鉴定

本研究旨在鉴定猪miR-135a-5p靶向脂肪发育的相关基因。首先,利用生物信息学软件分析发现,结肠腺瘤性息肉病(APC)基因的3′非翻译区(3′UTR)具有两个与猪miR-135a-5p结合的潜在位点。其次,构建APC基因野生型(APC3′UTR)和突变型(APC3′UTR m1、APC3′UTR m2、APC3′UTR m3)3′UTR双荧光素酶载体,并分别将其与miR-135a-5p mimics、阴性对照(NC)共转染PK-15细胞后检测荧光活性。结果显示:miR-135a-5p mimics显著降低APC3′UTR和APC3′UTR m2载体的荧光活性(P0.05),而APC3′UTR m1和APC3′UTR m3载体的荧光活性得到完全恢复,表明miR-135a-5p主要结合在预测的第一个位点。进一步的分析表明,miR-135a-5p抑制猪前体脂肪细胞内源APC基因的mRNA和蛋白质表达水平。研究结果证实,猪miR-135a-5p靶向APC基因,且调控其表达。本试验为深入研究猪miR-135a-5p的生物学功能及其调控脂肪形成的作用机制提供了基础。     

基于单细胞转录组测序技术对鄂尔多斯细毛羊次级毛囊形态发生诱导期的研究

【目的】试验旨在解析鄂尔多斯细毛羊胚胎期次级毛囊诱导期形态发生过程中主要细胞类型的分子特征和分化过程。【方法】对采集的3只鄂尔多斯细毛羊(胎龄87 d)体侧部(肩胛骨后缘处)的皮肤样本进行HE染色,鉴定毛囊的发育时期;部分皮肤样本经过混样后进行单细胞转录组测序(scRNA-Seq),应用t-分布随机近邻嵌入(tSNE)分析细胞簇,分别使用胶原Ⅰ型α1链(Col1a1)和角蛋白15(Krt15)鉴定真皮谱系细胞和表皮谱系细胞,并使用皮肤组织不同细胞的标记基因进行细胞类型分析;对测序数据进行拟时序分析,探究其分化过程中差异基因的表达;通过GO功能富集分析进一步验证基因的功能。【结果】HE染色结果发现,鄂尔多斯细毛羊在胎龄87 d处于次级毛囊诱导期。通过scRNA-Seq在胎龄87 d的细毛羊体侧部皮肤细胞样品中获得10 603个细胞和18 704个基因的scRNA-Seq数据可用于下游分析。tSNE分析发现,皮肤组织中共有15个细胞簇;Col1a1和Krt15标记基因鉴定表明,真皮细胞和表皮细胞具有高度异质性。拟时序分析构建毛囊形态发生过程中真皮/表皮细胞谱系细胞的分化轨迹和基因动态表达图...     

全基因组选择信号揭示绵羊毛囊发育及脱毛性状相关的候选基因

利用全基因组选择信号研究不同羊毛类型绵羊的群体结构及遗传分化程度,以挖掘与毛囊发育及脱毛性状相关的候选基因。本研究以3种羊毛类型的21个品种共290只绵羊群体为研究对象,利用Illumina Ovine SNP 50K芯片基因分型数据,基于群体分化指数Fst和核苷酸多样性比值θπ Ratio方法对无绒毛型、细毛型和中毛型绵羊进行选择信号检测。将Fst和θπ Ratio的top 5%作为阈值检测受到强烈选择的SNPs位点并进行注释。结果表明,SOX18、ALX4、FGF1和LRP4等与毛囊发育及脱毛性状相关的基因受到强烈选择。本研究通过Fst和θπ Ratio两种方法检测出与毛囊发育周期、羊毛形成以及毛囊和皮脂腺部分细胞相关的重要基因,这将为进一步研究绵羊重要经济性状形成的机制提供有意义的参考。     

HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸－酪氨酸蛋白（HGTP）启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著（P<0.01）,HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关（P<0.01）,与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关（P<0.05）,而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关（P<0.01）。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著（P<0.01）。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性（P<0.01）。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

布鲁氏菌侵染过程中has-miR-5196-3p对炎症小体的调控作用

试验旨在研究miRNA分子has-miR-5196-3p在布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中对NOD样受体蛋白3炎症小体（NLRP3）的调控作用。运用TargetScan、MiRDB等生物信息学预测网站预测has-miR-5196-3p和NLRP3-3'UTR的结合位点,构建其野生型及突变型双荧光素酶报告载体,分别与has-miR-5196-3p mimics及阴性对照共转染293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组相对荧光素酶活性的变化,验证has-miR-5196-3p和NLRP3-3'UTR的靶向关系;布鲁氏菌侵染THP1细胞,实时荧光定量PCR检测NLRP3、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase1）及has-miR-5196-3p mRNA的表达情况,Western blotting检测NLRP3和caspase1蛋白表达水平;将has-miR-5196-3p mimics、has-miR-5196-3p inhibitor及阴性对照转染至THP1细胞,实时荧光定量PCR及Western blotting检测NLRP3和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase1）的表达水平。结果显示,试验成功构建含有NLRP3-3'UTR的野生型及突变型双荧光素酶报告载体;has-miR-5196-3p mimics极显著降低pmirGLO-NLRP3-3'UTR-wt的相对荧光素酶活性（P<0.01）;布鲁氏菌侵染THP1细胞后,NLRP3炎症小体被激活,而has-miR-5196-3p无明显变化（P>0.05）;has-miR-5196-3p mimics能显著抑制NLRP3的表达（P<0.05）,而has-miR-5196-3p inhibitor则相反。结果表明,miRNA分子has-miR-5196-3p可与NLRP3-3'UTR结合并抑制其表达,布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中通过has-miR-5196-3p靶向负调节NLRP3炎症小体的表达及炎症的发生。     

新吉细毛羊角蛋白的EST筛选及表达研究

试验旨在从新吉细毛羊皮肤组织表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中筛选与毛囊发育相关基因并探讨其表达模式与羊毛细度的相关性。利用组装、比对软件Trinity与Blat对新吉细毛羊皮肤组织ESTs组装、注释进而筛选与毛囊发育相关基因,并通过实时荧光定量PCR相对定量方法以2^-△△Ct值检测相关基因在不同绵羊个体中的表达规律。结果显示,从474条ESTs中筛选注释获得了4个与毛囊发育相关的角蛋白基因KRT27、KAP3.2、KAP11.1和KAP8.1;4个角蛋白基因在超细型细毛羊皮肤组织表达量极显著高于细型细毛羊的表达量(P<0.01);4个角蛋白基因表达量:KRT27 >KAP3.2 >KAP11.1 >KAP8.1。该研究为角蛋白基因在细毛羊转录水平上的研究提供了一定数据。     

绵羊毛囊及其角蛋白研究进展

毛囊是毛纤维的生长基础,决定毛纤维的性状,角蛋白是毛囊组成的重要成分之一。近年来,对毛囊生长发育和角蛋白基因的挖掘等取得了一定的进展。文章回顾了绵羊角蛋白基因的发现,已经与人类角蛋白基因相当,但在数量和分类上存在差异;笔者介绍了绵羊毛囊的形态学结构,简述了毛囊角蛋白基因的表达定位和影响毛纤维性状的角蛋白,并分析了毛囊中的蛋白质组学技术的应用对毛囊生长发育和毛纤维性状的重要作用,以期为绵羊毛囊生长发育和羊毛性状的分子选育提供新的研究思路。     

绵羊毛囊及其角蛋白研究进展

毛囊是毛纤维的生长基础,决定毛纤维的性状,角蛋白是毛囊组成的重要成分之一。近年来,对毛囊生长发育和角蛋白基因的挖掘等取得了一定的进展。文章回顾了绵羊角蛋白基因的发现,已经与人类角蛋白基因相当,但在数量和分类上存在差异;笔者介绍了绵羊毛囊的形态学结构,简述了毛囊角蛋白基因的表达定位和影响毛纤维性状的角蛋白,并分析了毛囊中的蛋白质组学技术的应用对毛囊生长发育和毛纤维性状的重要作用,以期为绵羊毛囊生长发育和羊毛性状的分子选育提供新的研究思路。     

拟蜘蛛牵丝蛋白基因细毛羊毛囊特异表达载体的构建及其转基因细胞株的筛选

试验旨在获得具有毛囊表达特性的转蜘蛛牵丝蛋白基因细胞株。根据GenBank上发表的棒络新妇属蜘蛛的cDNA片段合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体S,加倍后连入pEGFP-N1框架载体以构建真核表达载体pK-2S,转染新疆美利奴细毛羊皮肤成纤维细胞后筛选单克隆,并通过PCR在DNA、RNA水平检测阳性克隆。基因合成后测序结果显示序列正确,酶切得到正确目的条带,筛选出阳性克隆并且可以在基因组及cDNA上扩增出目的片段。本研究成功将蜘蛛牵丝蛋白基因转入新疆美利奴细毛羊细胞,并在RNA水平表达,为培育毛囊特异表达蜘蛛牵丝蛋白基因并具有更高机械性能羊毛的新型细毛羊品种奠定基础。     

miR-186-5p调控猪原代前体脂肪细胞增殖和分化的研究

旨在探究miR-186-5p对猪原代前体脂肪细胞增殖和成脂分化的调控作用及机制.本研究采集7日龄健康马身猪公猪的颈部皮下脂肪,分离培养马身猪原代前体脂肪细胞;猪原代前体脂肪细胞分为4组,分别转染miR-186-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-186-5p抑制剂(inhibitor)及...