猪树突状细胞的体外培养及其主要免疫生物学特性研究

为建立体外诱导、培养猪外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)的方法,并对其进行免疫生物学特性鉴定,本实验从猪外周血无菌分离单核细胞—DC前体细胞,以猪源重组GM-CSF和IL-4联合诱导培养,从形态学、表型及功能方面对其进行检测。结果证实,经体外诱导培养的猪DC具有典型的树突状形态;培养6d的未成熟DC表面SLA-II-DR、CD1、CD172a表达的阳性率分别为61.50%、83.10%和24.90%;培养8d的成熟DC表面SLA-II-DR、CD1、CD172a表达的阳性率分别为71.70%、50.10%和19.30%;培养的DC具有吞噬异物的功能,以及刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。本文首次在国内成功地建立了体外培养猪外周血单核细胞来源DC的方法,为进一步研究DC在猪传染性疾病致病机制中的作用奠定了基础。     

鸡骨髓源树突状细胞体外转化培养

为深入探讨家鸡获得性免疫应答的分子机制,本研究探索了体外定向诱导和分化鸡骨源树突状细胞(Dendritic cell,DC)的方法。通过体外分离雏鸡骨髓源细胞,加入重组的鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)定向诱导培养获得大量未成熟DCs,经过接种新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)而激活,对其进行细胞形态学鉴定。结果表明:诱导4d后,部分细胞由单一的圆形球状逐渐生长呈短梭状;诱导6d后,细胞在40倍镜下可见基本呈短梭状且部分伸出触手;接种NDV后,细胞体积增大,触手伸长,形态趋于成熟,说明已成功建立体外利用细胞因子诱导分化鸡骨髓源DC的方法。     

含免疫增强剂CVC1302口蹄疫灭活疫苗缩短免疫应答窗口期机制的研究

为探究免疫增强剂CVC1302缩短口蹄疫灭活疫苗(KV)免疫应答窗口期的机制,本研究将灭活的O型口蹄疫病毒(FMDV)与CVC1302按照1.50配比后,与ISA206佐剂乳化制备疫苗(KV-CVC1302);将灭活的FMDV与ISA206佐剂乳化制备疫苗(KV),将上述疫苗分别免疫6周龄BALB/c雌性小鼠。免疫后7 d、28 d、56 d、90 d、120 d、150 d和180 d采血分离血清,利用O型FMD液相阻断ELISA(LBP ELISA)试剂盒检测各组小鼠血清FMDV特异性抗体水平。免疫后1 d,取注射位点肌肉,分别利用qPCR和ELISA检测其中细胞趋化因子的转录及表达水平。免疫后1 d、3 d、5 d和7 d分别采集注射位点肌肉及腹股沟淋巴结,制备单个淋巴细胞,利用流式细胞仪检测注射位点肌肉和腹股沟淋巴结的抗原递呈细胞(APC)[树突状细胞(DC)、巨噬细胞(Mph)、单核细胞(Mo)]的数量;免疫后1 d,利用流式细胞仪检测注射位点肌肉中DC的活化情况。结果显示,KV-CVC1302组小鼠FMDV特异性抗体水平、注射位点趋化因子转录及表达水平均显著高于KV组(p0.01、p0.001);且注射位点APC的数量及DC的活化水平也显著提高(p0.001),该组小鼠腹股沟淋巴结APC的数量也明显高于KV组(p0.05、p0.01或p0.001)。综上结果表明,CVC1302通过增强KV于注射位点诱导产生趋化因子的能力,募集大量的APC,进而对FMDV进行有效的捕获加工和递呈,转运至腹股沟淋巴结,诱导B细胞的形成,并分泌高水平抗体,从而缩短免疫应答窗口期。本研究首次证实CVC1302是在疫苗诱导免疫应答的启动阶段发挥作用,其通过募集活化的APC捕获更为有效的抗原以激活免疫系统,缩短了免疫应答窗口期,为后续研制新型免疫增强剂提供了新思路。     

猪外周血及骨髓源树突状细胞分化方法的建立

本研究对猪源树突状细胞(dendritic cell,DC)的分化条件进行了摸索,通过对试验猪只日龄的选择、刺激物浓度和刺激时间的比较以及DC表面分子标记的选择,确定了猪外周血和骨髓源DC的分化条件。静脉采集15日龄猪只抗凝血分离获得外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),贴壁12 h后,用终浓度80 ng/mL的GM-CSF和40 ng/mL的IL-4共同刺激7 d,用CD152作为DC的表面分子标志,试验结果显示:贴壁的单核细胞在GM-CSF和IL-4的共同刺激下,7 d后能够将超过60%的单核细胞刺激分化为CD152~+的DC。取15日龄猪只的股骨和胫骨并冲洗骨髓腔,参考外周血来源DC的分化方法,结果显示:可以获得约63%的骨髓源单核细胞刺激分化为CD152~+的DC。本研究建立的DC分化方法为进一步研究病毒感染后猪体建立获得性免疫应答的机制奠定了平台基础。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5对豚鼠树突状细胞成熟及功能影响

为研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白P5对豚鼠骨髓来源的树突状细胞(Dendritic cell,DC)刺激淋巴细胞增殖功能及细胞因子分泌的影响,以GM-CSF、IL-4联合诱导骨髓细胞生成未成熟DC,加入不同剂量副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5,观察DC形态,检测混合淋巴细胞反应,ELISA法测IL-6、IL-12p70、TNF-α分泌情况.结果显示:经副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5刺激后,可获得具有典型树突状突起形态的DC;经5μg·mL-1P5刺激的DC较对照IL-6、TNF-α分泌量极显著增加(P＜0.01),IL-12的分泌量有所增加(P＞0.05);50 μg·mL-1P5刺激的DC较对照IL-6分泌量极显著增加(P＜0.01),IL-12p70和TNF-α分泌量均极显著下降(P＜0.01).诱导后的DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力极显著增强(P＜0.01).本研究证明P5能影响骨髓细胞来源的DC的分化、成熟及功能的发挥,且不同剂量的P5对DC的成熟程度影响有差异.     

小鼠髓源未成熟树突状细胞的分离与培养

本试验旨在建立一种体外诱导培养小鼠未成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法。应用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)在体外诱导小鼠骨髓前体细胞分化为未成熟树突状细胞,进行形态学观察、细胞表型分析、刺激T细胞增殖等方法,对小鼠髓源未成熟树突状细胞的体外诱导培养进行鉴定。试验结果显示,小鼠骨髓来源的DC在体外培养8 d后,特异性细胞表面标志CD11c的表达量达到81.09%,中度表达MHCⅡ,低表达CD40、CD80、CD86。本试验成功地建立了体外小鼠髓源DC扩增的方法。     

猪CD205单克隆抗体的制备和特性研究

本试验旨在研制猪CD205单克隆抗体,并对猪CD205蛋白在淋巴组织、单核细胞来源的树突状细胞(DC)及分离自猪皮肤的DC中的表达进行比较分析。本研究制备了针对猪CD205C型凝集素样结构域5的单克隆抗体1.F6F6,Western blotting结果显示其能识别肠系膜淋巴结细胞中约200ku的蛋白质条带。流式细胞仪分析结果表明,单克隆抗体1.F6F6能分别识别28.5%、28.1%、34.1%和6%的细胞扁桃体、腹股沟和肠系膜淋巴结和胸腺细胞。约20%单核细胞来源的DC呈阳性,而LPS激活的细胞阳性率增加至36%。约70%猪皮肤中分离的DC表达CD205受体。识别CD205受体的单克隆抗体的制备为应用抗针对DC靶抗原的CD205抗体增强免疫应答的启动新策略提供了可能。     

猪繁殖与呼吸综合征免疫监测效果研究

猪繁殖与呼吸综合征是一种急性、高致死率的疫病,特点是发病急、传播迅速、防控难度较大。笔者对大兴区种猪场、规模猪场和散养户(A、B、C 3类)进行了抗原与抗体普查,应用弱毒苗(JXA1-R株)对猪群免疫,建立免疫程序。结果表明,普查检测C类场免疫抗体阳性率68.0%,抗原阳性率5%,该类场立即以JXA1-R株弱毒疫苗组织免疫,免疫后28 d采血再行检测提高到7 8.3%;A类和B类免疫抗体阳性率分别为7 8.0%、75.0%,抗原阳性率8.3%和8%。该类场1个月后免疫,免疫后28 d采血再行检测抗体阳性率分别提高到91.0%、91.2%,与普查抗体阳性率差异显著(P0.05)。随后分别建立了免疫程序免疫,以JXA1-R株弱毒疫苗对猪群进行免疫,对弱仔猪、病猪和带毒种猪的淘汰和免疫强度的增加,猪蓝耳病的免疫抗体水平都有所提高,抗体阳性率分别为90.8%、87.6%、86.3%,平均抗体阳性率88.1%,全区建立免疫程序免疫效率与首免前差异显著(P0.01)。对全区A类、B类、C类场分别进行了随机抽查抗原监测,2014年4月阳性率0.5%,取得较好免疫效果。     

巴马小型猪骨髓来源内皮祖细胞的培养鉴定及生物学特性分析简

为探索并建立巴马小型猪骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)的体外培养及鉴定方法,本研究在健康猪髂后上棘取骨髓,采用密度梯度分离法分离单个核细胞,按2×10⁷个/孔的密度加入预先包被人纤维连结素（HFN）的6孔细胞培养板中,用含内皮细胞生长因子的选择性培养基诱导培养,逐日在倒置相差显微镜下观察,MTT法检测EPCs增殖情况;流式细胞术（FACs）检测EPCs中AC133和vWF的表达纯度;免疫荧光法双染检测EPCs表面相关抗原ac-LDL和UEA-1。结果发现,从巴马小型猪骨髓分离的EPCs具有增殖能力;MTT结果显示细胞于48 h换液二次贴壁后3～5 d增殖明显,7～10 d增殖加速并出现条索状结构;FACs检测结果显示,二次贴壁细胞vWF阳性细胞百分率74.91%,AC133阳性细胞百分率79.54%,而未经诱导的二次贴壁细胞vWF和AC133阳性率分别是33.65%和39.87%;细胞经免疫荧光双染后Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1表达呈阳性,vWF和AC133免疫荧光染色阳性。由此可见,分离培养的细胞具有自我增殖和分化潜能,是内皮祖细胞。     

白细胞游走抑制琼脂糖试验用于诊断猪痢疾

用白细胞游走抑制琼脂糖试验(LMAT)已证明自然感染猪痢疾猪的细胞介导免疫(CMI)。猪痢疾密螺旋体的可溶性抗原能抑制猪痢疾患猪的白细胞游走,但不能抑制未感染猪的白细胞游走。在出现猪痢疾的临床症状之后,开始检出细胞介导免疫,2周后游走指数(MI)达最高值0.11(P<0.01)。在实验期的其余3周中游走指数逐渐下降。体液抗体水平与细胞介导免疫密切相关,因为两者都在相同的时间间隔内呈现最大值。4个月前感染猪痢疾的猪其白细胞具有显著的免疫应答,游走指数为0.73(P<0.05),而年龄和体重相当的未感染猪,其白细胞游走指数为0.94,差异不显著(P>0.05)。这些结果表明白细胞游走抑制琼脂糖试验可以用于诊断猪痢疾。     

猪肌内脂肪前体细胞分离培养和成脂诱导分化研究

为建立猪肌内脂肪前体细胞分离培养方法,为后续进行猪肌内脂肪沉积相关基因功能研究提供细胞模型,本研究采用胰酶消化法结合细胞差速贴壁法分离猪肌内脂肪前体细胞,通过诱导分化成功诱导出脂肪细胞,并进行油红O染色和甘油三酯含量检测。结果表明:采用胰酶消化结合细胞差速贴壁法能够成功分离出猪肌内脂肪前体细胞并稳定传代,获得的细胞纯度高,增殖和分化能力旺盛,具有典型特征的肌内脂肪前体细胞,冻存活率达90%以上;油红染色及甘油三酯含量检测结果显示,诱导分化第3天细胞内开始形成脂滴,第9天脂质沉积达高峰,继续培养至12 d甘油三酯含量增加不明显。综上,采用胰酶消化法结合细胞差速贴壁法能够获得稳定的猪肌内脂肪前体细胞,可为后续的基因功能分析提供实验素材。     

猪骨髓间充质干细胞分离培养和诱导分化脂肪细胞

采用全骨髓培养法分离猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)并传代培养;取第4代纯化的MSCs在成脂诱导培养基中诱导分化;分化的成脂细胞用形态学和油红O染色法进行鉴定;用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测成脂分化标志基因PPARγ2和LPL mRNA的表达情况。结果显示,分离培养的猪MSCs细胞经连续传代形态上无明显改变;MSCs在成脂分化培养液中诱导分化2d开始有少量脂滴出现,油红O染色成阳性,诱导18d成脂转化率可达59.8%;在诱导分化第5、10、15天时,PPARγ2mRNA相对表达量分别是(5.065±0.159)、(6.268±0.340)、(9.277±0.261),LPL mRNA的相对表达量分别是(10.995±1.473)、(13.130±0.712)、(15.762±0.934)。结果表明,用本诱导条件诱导猪MSCs向脂肪细胞分化,经形态学和油红O染色鉴定,成脂细胞分化率可达60%,且随分化时间的延长,脂肪细胞标志基因表达增加。     

重组酵母疫苗诱导细胞介导的保护性免疫

美研究人员报道 ,重组的全酵母疫苗能够激活树突状细胞 ( DC)并诱导保护性细胞免疫。研究人员在测试表达肿瘤和 HIV-1抗原的重组酿酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae)的免疫原性时发现 ,在不存在佐剂的情况下 ,用这种重组酵母免疫的小鼠能产生很强的包括肿瘤保护的抗原特异性 CTL反应 ,而且这种酵母还能刺激 DC的成熟和 IL-1 2产生 ,从而有效激发 MHC-1和 MHC-2限制的抗原特异性 T细胞反应。这项研究表明 ,重组酵母载体疫苗在诱导对多种传染病和肿瘤的有效细胞免疫方面也许有更强的作用重组酵母疫苗诱导细胞介导的保护性免疫@郭志…     

坏死梭杆菌白细胞毒素部分融合基因的真核表达及生物学特性研究

为了解坏死梭杆菌白细胞毒素的致病机制,本研究将实验室前期构建的坏死梭杆菌白细胞毒素基因部分融合基因的真核表达质粒(p PIC9K-bsbse-gas-sh)转化毕赤酵母KM71H细胞,1%甲醇诱导其表达目的蛋白;SDS-PAGE结果显示,甲醇诱导3 d后,重组BSBSE-GAS-SH蛋白以分泌形式表达于培养物上清液中,分子量约为117.9 ku;western blot表明重组蛋白能够与抗BSBSE抗血清发生反应,具有良好的反应原性;细胞毒性试验表明重组蛋白对小鼠肝细胞和巨噬细胞均具有细胞毒性作用,并且具有剂量依赖性,其中重组蛋白对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用更强。本研究为揭示坏死梭杆菌白细胞毒素致病机制提供了相关的实验数据。     

CpG DNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应

作者应用含CpG基序序列的重组质粒(即CpG DNA)作为免疫佐剂,评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗的免疫增强效果.结果表明:CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠,CpG DNA重组质粒对小鼠具有较强的免疫佐剂效应,能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体,其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍.CpG DNA重组质粒与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪,其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上,也显著高于空载体疫苗对照;与病毒纯化抗原配伍免疫动物,攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00,远高于标准疫苗对照(PD50> 4.69).在CpG DNA重组质粒剂量选择试验中,含低剂量的CpG DNA疫苗(50、200μg·头份-1)都比高剂量组(500 μg·头份-1)诱导的抗体滴度高,其中50和200μg·头份-1的CpG DNA剂量,在接种后14～32 d诱导的抗体滴度高达1:1 500,是标准疫苗的4～5倍,而500μg·头份-1剂量诱导的抗体仅是标准疫苗的2倍,说明CpG DNA重组质粒在低剂量时即可发挥强烈的佐剂效应.研究表明CpG DNA对猪O型口蹄疫病毒抗原疫苗有较强的免疫佐剂效应,且使用剂量低,应用前景广阔.     

猪支原体肺炎活疫苗（168株）气溶胶免疫后呼吸道sIgA分泌及抗原存留规律

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae ,Mhp)引起的猪的一种慢性呼吸道疾病,严重影响养猪业发展,活疫苗气溶胶免疫是防治该病的新措施。为研究猪肺炎支原体活疫苗(168株)经气溶胶免疫后,疫苗株在免疫猪肺内的占位存留规律,选用3周龄不吃初乳猪27头,随机分为3组,G1气溶胶免疫组12头,G2肺内免疫组12头,同时设立阴性对照3头。分别于免疫后第2 h、7 d、14 d及28 d进行鼻拭子Mhp sIgA检测以及血清抗体检测。另外在上述时间点分别宰杀G1和G2组各3头,对照组在实验组免疫后第28 d宰杀,采集肺泡灌洗液,分别进行Mhp sIgA检测及Mhp疫苗株含量检测。结果显示:(1)所有试验猪至实验结束,Mhp血清抗体未出现转阳现象;(2)鼻拭子sIgA水平G1组在免疫后第14 d与对照组相比上升,差异具有显著统计学意义(p <0.05);G2组在免疫后第7 d和14 d与相应的对照组相比上升,差异具有显著统计学意义(p <0.05),各时间点G1组与G2组sIgA水平差异不具备统计学意义(p >0.05);(3)G1组肺泡灌洗液中的 sIgA在免疫后14 d部分转阳(阳性率33.33%),28 d全部转阳(阳性率100%);G2组在免疫14 d时已全部转阳(阳性率100%),各时间点G1组与G2组sIgA水平差异不具备统计学意义(p >0.05);(4)气溶胶免疫组肺泡灌洗液内Mhp疫苗株浓度在免疫后第2 h、7 d、14 d和28 d分别是相应肺内免疫组的0.37倍、1.01倍、0.88倍以及0.52倍。猪支原体肺炎活疫苗(168株)经气溶胶免疫后,和肺内免疫一样可以诱导免疫猪的局部黏膜免疫以及具有同等的占位效应,且经气溶胶免疫的疫苗株在免疫仔猪体内的增殖水平可能与其诱导的黏膜免疫水平相关。     

树突状细胞甘露糖受体在旋毛虫感染中的变化研究

应用流式细胞术(FCM)检测旋毛虫感染后小鼠肠系膜淋巴结(MLN)中树突状细胞(DC)上甘露糖受体(MR)的影响。培养小鼠骨髓源树突状细胞(BMDC)并负载旋毛虫排泄/分泌抗原(ES抗原),FCM检测BMDC上MR的变化情况。结果显示,感染第7天MLN中DC表面MR出现下调,但在14 d后出现上调,差异显著(P0.05)。体外实验发现,BMDC负载ES抗原后MR出现下调,直到第48小时出现上调,差异显著(P0.05)。本研究证明旋毛虫感染后可以引起树突状细胞上MR的变化,表明MR可能是ES抗原的识别受体。这为研制旋毛虫树突状细胞疫苗提供了支持,并对寄生虫免疫逃避机制的研究提供了思路。     

华南地区规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫及流行情况调查

通过采用PCR和ELISA技术,对来自26个规模化猪场的保育猪(48~80日龄)的375份血液样品进行检测,结果显示猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原阳性率52.53%(197/375),抗体阳性率57.87%(217/375)。混群饲养后30 d,随机采集85头猪的血液样品,猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原阳性率27.06%(23/85),抗体阳性率94.12%(80/85)。本文结合猪只日龄、品种、免疫方式、疫苗毒株等方面,对华南地区PRRSV的免疫及流行状况进行调查分析,发现减毒苗中ATCCVR-2332株(经典株)免疫效果最好,灭活苗免疫后抗原阳性率最高,不同品种猪中杜洛克的感染率最低。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株S1片段的克隆表达及其抗体制备

通过对猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株S基因进行序列分析,选取S1蛋白502~641氨基酸位置,根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行密码子优化,PCR融合扩增片段,并将其克隆到原核表达载体上,获得重组质粒p ET32a-S417、p XXGST-S417。将获得的重组质粒转化到BL21感受态细胞,成功诱导表达、纯化,以GST-S417重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明:本试验所选区域具有好的抗原免疫原性,制备的多克隆抗体能特异性识别目的蛋白,为PEDV诊断试剂盒和疫苗研制提供了理论依据。     

昆虫细胞-杆状病毒系统分泌表达的猪瘟病毒E2蛋白及其免疫原性研究

为研制新型、可用于区分野毒感染、助力猪瘟净化的亚单位疫苗,本研究参考了近年来国内猪瘟病毒(CSFV)流行株的E2基因序列,并根据昆虫细胞密码子偏嗜性对其进行优化、合成后,克隆至转移载体中,构建了重组质粒,随后转化至含有穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac,制备了重组杆粒并转染至SF9细胞,获得了表达E2基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光试验和western blot检测结果显示该杆状病毒感染昆虫细胞后可正确表达E2蛋白(Bac-E2)。将Bac-E2(50μg/头份)与猪瘟兔化弱毒疫苗[HCLV,7500半数兔体感染剂量(RID50)/头份]分别免疫猪瘟抗体阴性仔猪,3周后用相同的剂量加强免疫。首免后5周Bac-E2组猪CSFV中和抗体均不低于11 024,显著高于HCLV组(p0.01);首免后35 d,利用105.0MLD(最小致死剂量)的CSFV石门强毒经耳后颈部肌肉注射攻毒后,Bac-E2和HCLV组猪的保护率均为100%,阴性对照组猪全部发病、死亡;采用荧光定量PCR检测各组猪口腔和肛门拭子中CSFV的排毒情况,结果显示Bac-E2和HCLV组猪攻毒后0～16 d的咽拭子及肛拭子中均未检测到CSFV核酸。阴性对照组猪攻毒后第4 d至濒死前均可在其拭子中检出高拷贝CSFV核酸。本研究为Bac-E2蛋白作为猪瘟亚单位疫苗的候选抗原蛋白奠定了研究基础。