甜菜磷酸蔗糖合成酶的转基因研究

将甜菜磷酸蔗糖合成酶(Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS)基因构建到植物表达载体pBI121上,利用农杆菌介导法对甜菜叶柄进行遗传转化.通过对转基因体系的优化,确定了农杆菌浓度OD.为0.6时,叶柄外植体经过2d的预培养,农杆菌侵染5mn,侵染受体共培养4d后,所获得的Kana抗性芽率最高.在所获得的27株Kana抗性植株中,通过提取甜菜基因组DNA及PCR鉴定,有8株成功整合了BvSPS基因,阳性率达到29％.     

提高甜菜遗传转化频率的研究

以甜菜叶柄为外植体，通过农杆菌介导转化，将玉米胚乳核糖体失活蛋白基因(cRIP)导入甜菜，对影响转化频率的因素：卡那霉素的浓度、头孢霉素的浓度、农杆菌感染时间和浓度等进行了探讨，初步建立了转化频率较高的转化系统．当卡那霉素浓度为100mg／L，头孢霉素浓度为500mg／L，农杆菌浓度OD值为0.3-0．4，感染时间为8～10min时．抗性不定芽分化率可达36．5％。该转化系统为转基因植株的获得奠定了基础。     

苦瓜蛋白MAP30基因转化番茄的研究

采用CTAB法提取苦瓜叶片总DNA,经PCR扩增、产物克隆及序列测定,获得序列正确的MAP30基因。构建植物表达载体,转化农杆菌,农杆菌工程菌株侵染番茄子叶,诱导出愈伤组织,并分化出芽和根,抗性植株经分子检测,得到在转录水平上表达MAP30基因的转基因番茄植株。     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

新疆甜菜品种(系)基因转化和再生体系的建立

根据植物发育的分子遗传学理论筛选到一种不依赖基因型、高频率再生、易重复、简单快速及周期短的组织培养体系,并利用农杆菌介导法将甜菜坏死黄脉病毒基因导入新疆甜菜品种(系),获得转基因植株,建立了新疆主栽甜菜品种(系)基因转化和再生体系。     

dsRNA介导的PRSV-CP基因3''-端同源序列瞬时表达对番木瓜环斑病毒侵染的影响

体外合成我国番木瓜主产区环斑病毒外壳蛋白(PRsv-CP)基因3'-端278 bp同源区段,构建包含278 bp正义链、内含子(PDK内含子)及278 bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,直接转化根癌农杆菌EHA105.通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究同源dsRNA对番木瓜环斑病毒(PRSv)侵染的干扰作用.结果表明,瞬时表达的dsRNA能够特异地干扰PRSV侵染.     

叶酸代谢途径folE基因表达载体的构建及在大豆中的转化

fol E基因是高叶酸调控基因,来源于细菌,已证明在西红柿等植物中,提高了叶酸含量。本试验采用农杆菌介导的大豆子叶节法,将fol E基因在大豆受体材料Williams82中表达。共侵染了200个外植体,得到34株转化苗。通过对转化苗进行除草剂(135 mg·L-1)涂抹鉴定,获得14株除草剂抗性转化苗。PCR检测结果显示其中12株为阳性。Southern杂交结果表明,fol E全长c DNA已成功插入到大豆基因组中,并得到2个单拷贝株系。     

木质素合成酶基因反义COMT对亚麻的转化及检测

COMT基因主要参与S木质素的生物合成,转基因植物在COMT活性被抑制时,木质素含量减少,利用杨树皮储藏蛋白(BSP)启动子和该基因构建成反义植物表达载体p BSP-antiCOMT-2301,利用农杆菌介导法将其转入亚麻,经过卡那霉素筛选获得了抗性的愈伤组织,诱导分化后获得了亚麻苗。经特异引物的PCR扩增,证明目的基因已经整合到亚麻基因组中,本研究获得的阳性转基因亚麻植株为亚麻纤维研究及品种选育奠定了坚实基础。     

根癌农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化影响因素研究

为建立和优化根癌农杆菌介导的大麦遗传转化体系,以大麦幼胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化大麦的主要影响因素。结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织诱导率为转化指标,筛选出了对大麦幼胚感染力比较强的农杆菌菌株EHA105,以及高敏感受体基因型甘啤4号和秀81-47等。实验结果还表明,预培养1 d的大麦幼胚具有较高的瞬时表达率(91%),是较好的转化受体。菌液侵染浓度OD600=0.5,侵染时间为30 min时转化效率最高。在此基础上,侵染后幼胚与农杆菌采用液体共培养方式可明显提高转化效率,gus基因瞬时表达率最高可达90%。在优化条件下,转化约30 d后抗选择剂潮霉素(Hyg)的愈伤组织占受体组织总数的34.2%。     

胞囊线虫侵染抗感大豆品种后根系谷胱甘肽代谢水平差异研究

以大豆胞囊线虫3号生理小种抗性品种灰皮支黑豆(ZDD2315)和感病品种辽豆15为材料,室内人工接种大豆胞囊线虫,检测抗、感品种侵染后二龄幼虫数量变化及根内活性氧变化,利用Real-Time Quantitative PCR分析了在大豆胞囊线虫3号生理小种互作下谷胱甘肽代谢途径相关基因在抗感大豆品种根内的相对表达量变化情况。结果表明:接种后第5天,抗感品种根内幼虫的数量大致相同;第15天,在灰皮支黑豆中,根内线虫幼虫数量减少;辽豆15根内H2O2含量始终略高于灰皮支黑豆;大豆胞囊线虫侵染后,谷氨酰胺半胱氨酸连接酶基因接种后3个时期的表达均上调;而谷胱甘肽合成酶基因在感病品种和抗病品种中处理组呈现了不同的表达趋势,尤其在接种15 d,在抗病品种灰皮支黑豆中表达下调,而在感病对照中表达上调;H型谷胱甘肽合成酶基因在抗性品种灰皮支黑豆中下调,说明谷胱甘肽相关基因的减少和下调在抗病品种灰皮支黑豆对大豆胞囊线虫的抗性呈正相关,导致大豆根系的氧化性增强,从而不利于大豆胞囊线虫的定殖和发育。     

刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。     

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

农杆菌介导的小麦幼胚遗传转化体系的优化

为了优化农杆菌介导的小麦幼胚转化体系,通过对4个小麦品种河农827、石新828、河农825、良星99的幼胚组织培养及再生系统的研究表明,在改良培养基MSW1和MSW2中,小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率与MSW0培养基相比分别提高了6.0%和5.4%,并且显著提高了植株再生能力。采用混合正交试验设计,对农杆菌遗传转化过程中小麦幼胚的诱导培养基、诱导时间、农杆菌侵染浓度、侵染时间进行了优化。结果表明,在诱导培养基MSW2,诱导培养6d,OD660=1,侵染时间3h时,愈伤GUS瞬时表达率及抗性愈伤成活率最高,对河农827成活的抗性再生植株进行PCR检测,获得了候选转基因植株。     

几丁质酶基因转化甜菜的初步研究

本试验通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导法将菜豆几丁质酶基因导入甜菜（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ,Ｌ．）,再生植株经卡那霉素筛选后,进行ＰＣＲ分析,结果表明：再生植株的转化率为２７．３％,甜菜叶柄是转化的较好受体。     

美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米的研究和抗病性检测

研究美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因转入玉米中对玉米纹枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转化玉米获得了大量再生转基因植株。PCR、PCR-southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明,目的基因已经整合到玉米基因组中,并且已经得到转译。     

马铃薯病毒外壳蛋白融合基因转化马铃薯及其抗病性分析

将多种病毒的有效核酸片断拼接成融合基因转入马铃薯可获得多抗马铃薯材料。针对马铃薯生产中分布广泛、危害严重并经常混合感染的马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)和马铃薯S病毒(PVS),开展了利用基因工程方法获得兼抗4种马铃薯病毒转基因马铃薯材料的研究。试验在前期获得含4种马铃薯病毒外壳蛋白基因片段的质粒pART27-XSYV-rh的基础上,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种‘陇薯3号’,PCR扩增和PCR-Southern杂交证明,4价融合基因已整合到马铃薯基因组中。qRT-PCR分析表明,该融合基因在转基因植株中能正常表达。3株转基因植株的抗病性鉴定结果表明,2株对4种病毒同时具有抗性;1株对PLRV侵染表现阳性,对另外3种病毒同时具有抗性。     

导入Chi—linker—Glu和Bar基因获得抗真菌和抗除草剂的转基因烟草

构建重组表达载体pBIb—CG（含有Chi-linker—Glu融合基因和Bar基因）,利用农杆菌介导法将其携带的Chi—linker—Gm融合基因和B4r基因转化烟草（Nicotiana tobaccumL）品种红花大金子。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg／LKan＋500mg／LCef筛选抗性芽．获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％：分别对抗性再生植株中Chi一砌ker—Glu融合基因和Bdr基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％。PCR、Souchem杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌fTricko derma viride）、镰刀菌（Fusarium solanif sppisii）和除草剂都表现出一定的抗性。     

转菰候选基因克隆获得抗白叶枯病水稻植株

以菰NBS-LRR类抗病基因同源序列FZ14(GenBank登录号:DQ239432)为模板设计特异性引物FZ14P1/P2,通过克隆池PCR法经分级筛选,从菰基因组TAC文库中获得1个阳性克隆(ZR1),序列分析比对证实该阳性克隆为含有菰抗病基因同源序列FZ14的抗病基因候选克隆。同时,ZR1具有植物NBS-LRR类型抗性基因中的P-loop(kinase1a)、kinase2、ki-nase3a和GLPL(Gly-Leu-Pro-Leu)等保守基序,可能为抗性基因的部分序列。通过农杆菌介导转化水稻品种日本晴,获得36个对白叶枯病菌PXO71具有明显抗性的独立转化子,结果表明,菰ZR1克隆中至少含有1个白叶枯病抗性基因。     

一种E.coli-Free的酵母同源重组系统稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法

侵染性克隆是研究病毒的重要工具,而偏大的病毒基因组及其在大肠杆菌中的不稳定给构建侵染性克隆造成很大困难。通常采用插入内含子和酵母同源重组等方式可以获得稳定克隆,但本实验最初利用酵母同源重组系统并未成功构建番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)的侵染性克隆。经研究证实,该不稳定现象确实存在于大肠杆菌中,而非酵母和农杆菌细胞。通过改良酵母同源重组方法,成功构建了有/无内含子intron 2的PLDMV侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2,农杆菌注射接种番木瓜均发病,侵染效率达64.7%~69.7%。本研究通过酵母同源重组质粒直接转化农杆菌,建立了一种10 d内即可稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的E.coli-Free酵母同源重组新方法。该方法对其他在大肠杆菌中不稳定的植物病毒侵染性克隆的构建具有重要意义。     

农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织遗传转化体系的建立

以玉米自交系8902、340、4112未成熟幼胚为材料,诱导、继代筛选出良好的Ⅱ型胚性愈伤组织,用农杆菌(EHA105和LBA4404)介导法转化其愈伤组织.利用本室构建的植物双元表达载体中携带的GUS报告基因对农杆菌转化系统的条件进行了研究,如农杆菌的侵染浓度、菌种类型、侵染时间、A8(乙酰丁香酮)浓度及基因型等,建立了农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织高效遗传转化体系。