食源性单增李斯特菌inlA/inlB/inlC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究内化素inlA/inlB/inlC基因对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)生物学特性的影响,本研究采用融合PCR方法构建Lm681 inlC基因缺失突变体,并构建pKSV7-△inlC穿梭载体,将其转化Lm681-△inlAB感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg/mL)抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组子进行鉴定并研究其部分生物学特性。结果显示,PCR和测序结果证实成功构建了3基因缺失株(Lm681-△inlABC),且缺失株的生长特性与野生株相比无明显差异,溶血特性与野生株保持一致;小鼠感染试验显示,野生株Lm681、Lm681-△inlAB和Lm681-△inlABC对小鼠的致死率分别为80%(8/10)、60%(6/10)和40%(4/10),对小鼠的LD50分别为4.36×10~4、1.35×10~6和2.95×10~7 CFU,且Lm681-△inlABC在肝脏、脾脏及脑组织中的定植能力极显著低于野生株(P<0.01)。研究结果表明,inlA/inlB/inlC基因对Lm致病性发挥具有一定的作用,为深入研究inlX基因介导Lm入侵宿主细胞过程中的作用机制提供了科学依据。     

食源性单增李斯特菌inlA/inlB/inlC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究内化素inlA/inlB/inlC基因对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)生物学特性的影响,本研究采用融合PCR方法构建Lm681 inlC基因缺失突变体,并构建pKSV7-△inlC穿梭载体,将其转化Lm681-△inlAB感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg/mL)抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组子进行鉴定并研究其部分生物学特性。结果显示,PCR和测序结果证实成功构建了3基因缺失株(Lm681-△inlABC),且缺失株的生长特性与野生株相比无明显差异,溶血特性与野生株保持一致;小鼠感染试验显示,野生株Lm681、Lm681-△inlAB和Lm681-△inlABC对小鼠的致死率分别为80%(8/10)、60%(6/10)和40%(4/10),对小鼠的LD50分别为4.36×10~4、1.35×10~6和2.95×10~7 CFU,且Lm681-△inlABC在肝脏、脾脏及脑组织中的定植能力极显著低于野生株(P0.01)。研究结果表明,inlA/inlB/inlC基因对Lm致病性发挥具有一定的作用,为深入研究inlX基因介导Lm入侵宿主细胞过程中的作用机制提供了科学依据。     

单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析内化素InlK对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性及致病性的影响,利用自杀性质粒进行同源重组构建LM标准菌株10403s的inlK基因缺失株,然后比较分析野生株、inlK基因缺失株的生长特性、生物被膜形成能力、细胞侵袭能力、动物致病力等差异。结果显示,inlK基因缺失不影响LM的生长速度,但可导致LM的生物被膜形成能力下降。细胞感染试验表明基因缺失株ΔinlK对RAW264.7细胞的侵袭及胞内存活能力分别下降了18%和31%。动物感染试验显示野生株和基因缺失株ΔinlK对小鼠的致死率分别为80%(4/5)和40%(2/5),且基因缺失株ΔinlK的体内定殖能力显著低于野生株。本研究表明内化素InlK在LM感染过程中发挥着重要作用,为了解LM的致病作用提供参考。     

单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究

为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。     

不同来源单核细胞增多性李氏杆菌inlB和actA基因的克隆测序分析及基因缺失株的毒力试验

根据GeneBank上发表的单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)的内化素B(internalin B,inlB)和肌动蛋白A(actin A,actA)基因设计特异性引物,对5株不同来源的健康绵羊单核细胞增多性李氏杆菌和一株临床分离的单核细胞增多性李氏杆菌的inlB及actA基因进行PCR扩增,克隆测序分析其序列,并对2株部分基因缺失的单增李氏杆菌进行小鼠攻毒试验。结果表明:5株健康绵羊分离株单增李氏杆菌与临床分离株有较高的同源性,并且发现2株部分基因缺失的单增李氏杆菌;小鼠攻毒试验表明缺失株毒力有降低,但是不明显。     

单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

为分析单增李斯特菌溶血素S(listeriolysin S,LLS)llsB基因缺失对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性的影响,本研究利用同源重组构建了llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,并以8周龄、体重40g±5g的健康昆明系雄性小鼠为试验动物对其生长特性、半数致死量(LD50)、脏器载菌量等生物学特性进行了初步研究。结果显示,本研究成功构建了llsB基因缺失株;缺失株在体外连续培养20代过程中能稳定遗传。通过生长曲线测定发现,llsB基因缺失株生长活性略高于亲本株;小鼠感染试验结果显示,亲本株和缺失株的LD50分别为106.17和106.50 CFU;与亲本株相比,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均极显著减少(P0.01),说明缺失株对小鼠的感染能力明显减弱。在小鼠脑中未检出单增李斯特菌。综上所述,llsB基因对LM90的部分生物学特性可能有直接或间接的调控作用,本试验结果为进一步研究LLS的致病机理及防控李斯特菌病提供一定的理论依据。     

单增李斯特菌溶血素LLS/LLO缺失株的构建及小鼠免疫保护性研究

旨在探究单增李斯特菌溶血素S/O(LLS/LLO)对单增李斯特菌(LM)的部分生物学特性影响及单增李斯特菌溶血素S/O基因缺失株的免疫原性。利用同源重组技术在本实验室已成功构建并保存的LM90SB2Δlls菌株基础上构建LM90SB2Δlls-Δllo,并绘制LM90SB2和LM90SB2Δlls-Δllo的生长曲线，测定半数致死量(LD₅₀)、组织载菌量(同时采用灌服和腹腔注射方式)等，进行小鼠免疫保护性研究，分析溶血素基因llsB/hly缺失对LM的生长特性以及毒力的影响。结果：成功构建LM90SB2Δlls-Δllo缺失株，且能在体外稳定遗传。测定生长曲线，LM90SB2的生长活性略高于LM90SB2Δlls-Δllo; LM90SB2的LD₅₀为3.65×10^7.23 CFU,LM90SB2Δlls-Δllo的LD₅₀大于2.7×10⁹ CFU;通过灌服及腹腔注射，与LM90SB2相比，LM90SB2Δlls-Δllo在小鼠脑、肝、脾中的载菌量均明显减少，差异极显著(P...     

内化素A/B对单增李斯特菌在模拟酸性胃环境中耐受性的影响

单核细胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes,LM)是一种重要的食源性病原菌,它可以通过人口途径进入胃肠道,并穿越屏障进入肠道细胞中定殖并感染,由此可见该菌引起食物中毒的首要条件是抵抗人体内恶劣的酸性胃环境。本研究以单增李斯特菌LM90SB2及内化素基因缺失株LM90SB2ΔInlAB、LM90SB2ΔInlA、LM90SB2ΔInlB为受试菌,对4株菌进行生长曲线的测定,对其携带毒力基因溶血素(hly)扩增验证;不同pH条件下的生长曲线测定,以及模拟酸性胃环境中的耐受性研究。结果表明2～6 h 4株菌处于对数生长期,并均携带溶血素O的毒力基因hly,适宜生长的pH为6～7,pH=9时LM90SB2生长显著高于LM90SB2ΔInlAB(P0.05)。受试菌在模拟胃环境中的存活率与其pH及作用时间相关,当pH=3.5时,4株菌的存活率依次为LM90SB2LM90SB2ΔInlA LM90SB2ΔInlBLM90SB2ΔInlAB;当pH=2.5时LM90SB2生长极显著高于LM90SB2ΔInlAB(P0.01),且随着时间的推移,4株菌生长曲线均呈下降趋势;当pH=1.5时,LM90SB2在l h、2 h时分别有0.075%及0.03%的存活率,而缺失株的存活率为0。研究表明,内化素A/B在LM抵抗人体酸性胃环境中发挥重要作用。     

单核细胞增生李斯特菌非编码RNA rli87基因缺失株的构建、鉴定及其生长特性初步研究

拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株,对其进行分子鉴定,分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5 rli87基因缺失突变体,并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体,将其转化入LM-SB5感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg·mL-1)的抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组菌进行分子鉴定,测定缺失株与母源野毒株37℃条件下生长曲线。结果显示:PCR和测序结果证实成功获得了LM-Δrli87重组菌。通过25代的连续传代,PCR鉴定结果显示,该缺失株具有良好的遗传稳定性。与野毒株进行对比,在37℃条件下缺失株与野毒株的生长差异不显著(P0.05)。非编码RNArli87基因在37℃条件下对LM生长没有明显的调控作用。     

Ⅵ型分泌系统分泌蛋白ClpV对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究clpV对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组构建了APEC DE17株的clpV缺失株DE17ΔclpV及其回补株DE17CΔclpV,比较分析了野生株、缺失株和回补株的生长曲线,运动性和生物被膜(BF)形成能力;对DF-1细胞的黏附、侵入能力以及通过荧光定量PCR检测clpV缺失后对Ⅵ型分泌系统(T6SS)相关基因转录水平的影响。结果显示,通过Red同源重组构建了clpV基因缺失株与回补株,利用分光光度计测OD600nm绘制野生株、缺失株和回补株的生长曲线。结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV生长速率无明显变化;其运动和BF形成能力的检测结果显示,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV的运动能力降低(p0.05),而其BF形成能力则升高(p0.05);分别将DE17、DE17ΔclpV和DE17ΔclpV感染DF-1细胞,与野生株相比,缺失株DE17ΔclpV对DF-1细胞的黏附能力升高(p0.01),而侵入能力减弱(p0.01)。荧光定量检测结果显示,与野生株相比,clpV缺失株csgD、icmF、lip和hcp基因的转录水平升高(p0.05),而vgrG和rpoD基因的转录水平降低(p0.05)。本研究结果表明,T6SS的分子伴侣ClpV影响APEC的生物学特性,为进一步研究T6SS的功能及其致病机制提供参考。     

flaA基因的缺失对绵羊脑炎单核细胞增生李斯特菌的细胞黏附、侵袭能力及生物被膜形成能力影响的研究

为了探究flaA基因对单核细胞增生李斯特菌LM90SB_2黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7能力、生物被膜(BF)形成能力的影响,本研究分别进行了flaA基因缺失株LM90SB_2-ΔflaA与野毒株LM90SB2对细胞黏附和侵袭试验,定性定量分析了他们生物被膜形成能力以及小鼠不同脏器中载菌量差异。结果显示:LM90SB_2-ΔflaA对MBMEC的黏附菌数较野毒株LM90SB_2低,且两者差异性显著(P<0.05),两者对MBMEC的侵袭数差异性不显著(P>0.05),而LM90SB_2-ΔflaA对RAW264.7的黏附和侵袭数均显著低于野毒株LM90SB_2(P<0.05);LM90SB_2-ΔflaA与LM90SB_2的BF形成规律基本相同,但缺失株形成的BF总量显著低于野毒株的(P<0.05),且与野毒株相比,缺失株的BF结构中核酸与多糖的分布均松散、稀疏、散点状分布。本研究结果表明,flaA基因对LM90SB_2的细胞黏附和侵袭能力均有影响,在其BF形成过程中发挥着重要的作用。     

鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性，本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象，采用λ-Red同源重组技术，分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株，并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养，对各菌株生物学特性进行比较；通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性；采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性；将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠，测定各菌株对小鼠的毒力，并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明，正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示，与亲本株相比，A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001)，不产酸、不产生H₂S，菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐，不产生H₂S，菌体极显著变长(P<0.001)，表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示，菌株传至60代时，基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示，与亲本株比较，A...     

布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。     

布鲁氏菌DnaK基因缺失株的构建及其功能初步评价

为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选该菌疫苗株M5-90的DnaK基因缺失株,并对获得的M5-90ΔDnaK遗传稳定性、生长曲线、毒力和细胞免疫指标进行检测。结果表明,M5-90ΔDnaK与M5-90体外生长曲线相似, M5-90ΔDnaK在胞内的存活能力显著低于M5-90 (p0.05), M5-90和M5-90ΔDnaK诱导小鼠血清IFN-γ水平相似(p0.05),并且均显著高于PBS组(p0.01)。结果表明,M5-90ΔDnaK有望成为毒力低且可诱导机体细胞免疫的疫苗候选株。本研究为布鲁氏菌致病机制的研究和疫苗的研发提供科学依据。     

单增李斯特菌hly基因缺失株的构建及重要特性分析

为构建单增李斯特菌(LM)hly基因缺失株,并分析其生物学特性和免疫保护效果,本研究利用同源重组技术获得基因缺失株LM△hly112-153,研究该缺失株对巨噬细胞的侵袭力、溶血能力并测定其LD50,同时评价该缺失株对小鼠的免疫保护效果。结果显示经PCR扩增及序列分析表明获得基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对巨噬细胞的侵袭能力显著下降(p<0.01);其溶血活性比野生株降低2个滴度;并且该缺失株对BALB/c小鼠的LD50为4.253×108 cfu,高于野生株3个数量级;免疫保护试验显示,经缺失株免疫的小鼠对野生株攻毒有75%的免疫保护率。本研究构建了基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对小鼠具有较好的免疫保护效果,以上研究为减毒李斯特菌疫苗载体的研发奠定重要基础。     

豫西地区市售鸭翅中单增李斯特菌毒力基因的检测

为分析来自豫西地区市售鸭翅中单增李斯特菌毒力基因的分布变化,本研究以分离自豫西地区市售鸭翅的11株单增李斯特菌分离株为研究对象,利用PCR方法进行8种毒力基因的检测(inlA、inlB、virR、mprF、dltA、dltB、dltC、dltD基因)。结果显示有3株出现了基因缺失,dltA基因检出率为90.9%(10/11),dltC、mprF基因检出率均为81.8%(9/11),其他基因全部呈阳性。这些毒力基因在单增李斯特菌分离株中分布广泛,对豫西地区市售鸭翅具有潜在的威胁,应引起食品监管部门的高度关注。     

单核细胞增生李斯特菌NTSNΔ0287缺失株的构建及其生物学特性

内化素蛋白家族是一类重要的表面蛋白,其与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的黏附侵袭作用密切相关。Lm NTSN_0287基因编码含有信号肽序列和LRR重复结构域的内化素家族蛋白,其作用机制有待于阐明。通过荧光定量PCR的方法,发现该基因在Lm侵袭Caco-2细胞时上调表达,达到体外表达量的1 300倍。为明确该基因的生物学特性,研究利用同源重组技术构建了LmNTSNΔ0287缺失株。与野生株相比,NTSNΔ0287缺失株对Caco-2细胞的黏附与侵袭能力均显著降低,对HeLa细胞的黏附能力下降,侵袭能力增加。经口服和尾静脉途径接种BALB/c小鼠,NTSNΔ0287缺失株在脾脏和肝脏中的载菌量均降低,但其LD_(50)与野生株相比无明显差异。因BALB/c小鼠缺乏人所特有的细胞表面内化素受体E-cad,并不是最佳实验动物模型,下一步将选用同时具有内化素受体E-cad和Met的沙鼠做进一步研究。     

溶血素基因缺失对单增李斯特菌在小鼠肠道内定殖的影响

旨在探究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)溶血素hly、llsB基因对小鼠肠道的影响。在构建Lm的hly基因缺失株基础上,以Lm90SB2及溶血素基因缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB为试验菌,进行生长曲线、溶血活性以及器官载菌量的测定。结果：缺失株在不同条件下的生长特性与亲本株相比无明显差异;Lm90SB2、Lm90SB2-ΔllsB的溶血效价分别为1log2、2log2,而Lm90SB2-Δhly基本无溶血现象。缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB的肠道载菌量均低于亲本株Lm90SB2(P<0.05),在各个时间点肠道中的细菌定殖率依次为Lm90SB2>Lm90SB2-Δhly>Lm90SB2-ΔllsB。本研究表明,hly、llsB基因对Lm在小鼠肠道内定殖可能有直接或间接的调控作用,试验结果为进一步研究hly、llsB基因在Lm致病过程中的作用提供一定的理论依据。     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...