绵羊肺炎支原体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)的检测方法,本研究根据GenBank登录的Mo Y-98株(KR021380.1)黏附素基因p113基因序列设计1对特异性引物和探针,建立了针对Mo的TaqMan荧光定量检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测Mo,对丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、莱氏无胆甾原体及羊传染性脓疱病毒(ORFV)等羊常见病原扩增结果均为阴性;该方法最低检测限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%;采用该方法对96份临床样品进行检测,结果 Mo的阳性率为67.7%(65/96),比常规PCR法及支原体分离鉴定法更加敏感。以上结果表明本研究建立的Mo TaqMan荧光定量PCR方法可以用于Mo的准确快速检测及羊支原体性肺炎的诊断和流行病学调查。     

应用双重PCR方法检测羊支原体肺炎病原

通过对丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri,Mmc)特异性引物MmcF/MmcR和绵羊肺炎支原体(M.ovipneumontiae,Mo)特异性引物LmF/LmR退火温度、引物浓度比例等条件的选择,建立了一个可以同时检测Mmc和Mo的双重PCR方法。该方法可同时扩增出Mmc 195 bp和Mo 361 bp目的片段,但对其他病原菌不能扩增出任何条带,具有良好的特异性。敏感性试验表明,该方法能够分别检测出0.1ng的Mmc DNA和0.01 ng的Mo DNA,或同时检测出1ng Mmc和1ng Mo混合的DNA。用该双重PCR方法可对实验室保存的4株绵羊肺炎支原体和2株丝状支原体山羊亚种进行准确鉴定,并可从临床病料中检测出相应支原体,表明建立的双重PCR方法可用于Mmc和Mo的快速鉴定、实验室诊断和病原学调查。     

羊丝状支原体簇环介导等温扩增检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了羊丝状支原体簇的快速检测方法,该方法以羊丝状支原体簇成员的保守性基因16S rRNA为靶序列,设计了4条特异性引物,在65 ℃等温条件下,60 min一步完成反应。在反应管中预先添加羟基萘酚蓝(HNB),阳性呈蓝色,阴性呈紫色。丝状支原体簇成员——丝状支原体山羊亚种(Mmc)、丝状支原体丝状亚种LC型(Mmm LC)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的LAMP检测为阳性;对其他病原菌没有交叉反应。以Mmc的核酸为模板进行灵敏度检测,LAMP的最低检出限为10 pg/μL。结果表明,本试验建立了一种特异、敏感、快速、简便的羊丝状支原体簇的LAMP方法。     

山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重 PCR 检测方法的建立

为建立一种能够同时检测山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的双重 PCR 方法，本研究采用2对特异性引物，对退火温度和引物浓度比进行了优化，成功建立了一种能同时检测上述两种病原的双重 PCR 方法。结果显示，该方法具有很好的特异性，仅对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌有扩增，而对其他常见的羊呼吸道病原无扩增；该方法对两种病原的检测限分别为32 pg 和50 pg，与单独 PCR相同；26份临床样品中山羊支原体山羊肺炎亚种的检出率为23．1％，多杀性巴氏杆菌的检出率为26．9％。所建立的双重 PCR 具有特异性好、灵敏度高的特点，为临床上这两种病原感染的快速诊断和流行病学调查等提供了更为有用的手段。     

绵羊肺炎支原体和丝状支原体双重PCR检测方法的建立

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumonia)和丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.Capri,Mmc)是羊传染性胸膜肺炎(又称为羊支原体性肺炎)的常见病原.此外,山羊支原体山羊肺炎亚种和山羊支原体山羊亚种等支原体也可引起羊传染性胸膜肺炎.     

羊呼吸道主要支原体和细菌病原的多重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能够同时检测绵羊肺炎支原体、丝状支原体簇成员、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌4种羊呼吸道主要病原的多重PCR方法,本研究采用各病原的特异性引物,经优化反应条件,建立了一种可以同时检测以上4种病原的多重PCR方法,并对128份临床样品进行了检测。结果显示,该方法对其它细菌和支原体扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对以上4种病原基因组DNA的检测下限分别为2.2×10~3拷贝、2.1×10~3拷贝、1.1×10~3拷贝和8.3×10~2拷贝。该方法特异性强、敏感性高,为上述4种病原的快速检测和鉴定,以及临床羊呼吸道疾病的诊断提供了一种方便、快捷和准确的工具。     

绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和精氨酸支原体多重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登陆的绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(MmC)和精氨酸支原体(M.arg)的相关基因序列,分别设计了扩增MO hsp70基因、MmC hsp70基因和M.arg ADI基因片段的特异性引物,通过对反应条件和反应体系的优化,建立了MO、MmC和M.arg的多重PCR检测方法。特异性试验结果显示:该方法能同时扩增出MO 703bp、MmC 385bp和M.arg223bp的特异性目的片段,而对其他病原的DNA扩增为阴性。敏感性试验结果显示:该方法对这3种支原体的最低核酸检出量均为10pg。55份临床样品检测结果表明:三重PCR检测结果与分离培养诊断方法一致,均能检测出样品中的病原菌。本试验建立的多重PCR方法能为MO、MmC和M.arg的感染提供正确快速诊断方法。     

山羊支原体山羊肺炎亚种野毒株的分离鉴定

为获得山羊传染性胸膜肺炎病原野毒株,采集陕西杨凌某羊场疑似患山羊传染性胸膜肺炎山羊的鼻分泌物,进行PCR检测,病原分离培养,菌落形态观察,生化培养试验鉴定,PCR鉴定,基因序列测定分析,动物回归试验。结果显示,PCR检测鼻液分泌物呈山羊支原体山羊肺炎亚种阳性;菌落呈现中心脐、边缘光滑、油煎蛋状样;能发酵葡萄糖、不水解精氨酸、不分解尿素、能还原四唑氮、膜斑试验阴性、可液化马血清、消化酪蛋白,对洋地黄皂苷敏感;基因测序结果显示与GenBank中已收录的山羊支原体山羊肺炎亚种基因同源性为99.8%;动物回归试验结果显示,该菌株对山羊造成了严重的胸膜肺炎,具有致病性。结果表明,成功分离出1株山羊支原体山羊肺炎亚种野毒株。     

山羊传染性胸膜肺炎继发流产病例的诊断

为对贵州省某规模养羊场临床表现咳嗽、消瘦及流产症状病死山羊进行病因确定性诊断,采用分子生物学方法对病死山羊进行山羊传染性胸膜肺炎(CCPP)病原与山羊流产衣原体核酸检测。结果表明,从病死母羊肺组织中检测到绵羊肺炎支原体(Mo)核酸,未检测到丝状支原体山羊亚种(Mmc)核酸,病死母羊子宫组织中山羊流产衣原体检测均为阴性,病例确诊为CCPP。序列分析显示Mo感染可能与流产症状有关。研究结果将为贵州省预控此类疫病流行暴发提供技术支持。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒和支原体混合感染山羊的诊断

<正>2016年10月福州市一山羊养殖户的山羊发病,经临床症状、剖检病变及实验室检验,确诊为羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus,ENTV)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)和丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri,Mmc)混合感染引起的山羊呼吸     

山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎混合感染的检测与分析

利用特异性PCR方法从病山羊组织病料中分别扩增山羊痘病毒、羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种特异性片段,继而将扩增的特异性片段克隆、测序,并与GenBank上相应的基因序列进行比对、绘制系统进化树,进行流行病学分析。结果表明,从病山羊中可同时扩增出山羊痘病毒、羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种特异性片段,并通过基因序列比对分析确证了PCR检测结果,首次证实我国存在山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎的混合感染,为我国现阶段羊病的流行病学和有效防制措施的制定提供了参考依据。     

羊传染性胸膜肺炎的诊治与防控措施

羊传染性胸膜肺炎又称羊支原体性肺炎,其病原体主要为国内流行的优势病原丝状支原体山羊亚种(Mmc)和绵羊肺炎支原体(Mo)。Mo能够感染绵羊和山羊,而Mmc仅感染山羊,以3岁以下的山羊最易感染。本病主要传染源是病羊,通过飞沫-空气经呼吸道传播,且多发于早春、秋末和冬初时节,呈地方性流行。现将一起羊传染性胸膜肺炎的发病与诊治情况介绍如下。     

山羊支原体肺炎亚种Hsp70基因克隆与序列分析

山羊传染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolum subsp.Capripneumoniae,Mccp)引起的高度接触性传染病,热休克蛋白Hsp70,在Mccp所有蛋白翻译后功能和结构的表达起作用。以Mccp中国分离株87001为模板,扩增了Hsp70的全序列,将该序列克隆到pMD18T载体上并测序。将序列与其它已知动物支原体的Hsp70序列进行分析比较。测序结果87001株Hsp70基因全长1773bp,编码591个aa,第631～633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体Hsp70基因进行分析比较,发现87001株Hsp70基因与山羊支原体山羊亚种(Mcc)、丝状支原体丝状亚种SC的DNA同源性为99.3%～99.4%,氨基酸同源性为99.2%～99.3%,而与非同种支原体猪肺炎支原体232株等Mhp菌株的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%～74.4%和59.3%～77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。原核表达得到大小为41Kd的目的蛋白,经Westernblot证实,纯化蛋白可与Mhp阳性猪血清反应,具有免疫活性。     

山羊支原体山羊肺炎亚种甘肃株的分离及鉴定

2007年甘肃某地羊场山羊发生以呼吸困难、咳嗽和胸膜肺炎为特征的呼吸道传染病,经临床诊断为羊支原体性肺炎.用改良的Thiaucourt's培养基对病山羊的肺组织进行病原分离,成功分离到1株支原体M1601,经菌落形态观察、生化试验、PCR鉴定、以16S rRNA基因序列构建的分子进化树分析和动物致病性试验,证明该分离株属于山羊支原体山羊肺炎亚种.     

一例山羊支原体性肺炎的诊治及防控措施

该病例是由引种带入传染源而引起,病料经PCR检查判断该病由绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)混合感染所致,通过综合防控,取得了较好的治疗效果。     

一种山羊支原体山羊肺炎亚种多重抗原肽的小鼠免疫试验

旨在构建一种由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum Subsp.capripneumoniae,Mccp)六个B细胞表位和三个T细胞表位组成的多重抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),将其在大肠杆菌中表达后免疫小鼠,评估其体液免疫和细胞免疫。分别用MAP、单个B细胞表位及全菌超破抗原作为抗原,检测免疫小鼠抗体水平,结果显示三种抗原均能和小鼠免疫血清发生很好的反应(P0.01)。体外代谢抑制试验显示,1∶64倍稀释的免疫小鼠血清可以有效抑制Mccp的生长。淋巴细胞增殖试验显示,当用单个T细胞表位及Mccp超破抗原分别刺激免疫小鼠的淋巴细胞时均产生明显的增殖现象(P0.01)。细胞因子检测结果显示,免疫小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-10产量明显升高(P0.001),而IL-12产量明显下降(P0.001)。数据显示,构建的MAP能够引起小鼠的免疫反应,这一结果为由Mccp引起的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了一定的基础。     

山羊支原体山羊肺炎亚种培养基的筛选及生长曲线测定

为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加2g/L丙酮酸钠和150mL/L马血清的Thiaucourt肉汤培养基最适宜山羊支原体山羊肺炎亚种的生长,生长滴度可达109 CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养60h后进入稳定期,培养72h时后进入衰亡期。此试验结果为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究提供了参考数据。     

山羊支原体山羊肺炎亚种湖北株的鉴定及其外膜蛋白的免疫原性研究

从湖北某地山羊肺脏中分离支原体,经多次克隆纯化后进行生化试验、显微镜观察、PCR及酶切分析、基因特征鉴定以及用动物致病性试验对该菌株进行了鉴定,命名为GH2,进一步通过免疫印迹对GH2株外膜蛋白及GH2株全菌蛋白免疫原性进行分析,并用抗Y98血清和抗PG3血清进行比较,筛选GH2株特异性的外膜蛋白,结果表明GH2株为山羊支原体山羊肺炎亚种,存在于GH2外膜蛋白中的相对分子质量大约为60和49.7 ku的蛋白可能是其主要的免疫原性蛋白,也是GH2株区别于丝状支原体山羊亚种标准株PG3和绵羊肺炎支原体标准株的主要特异性抗原.这一结果为山羊支原体山羊肺炎亚种的诊断和疫苗研制提供了良好的理论基础.     

丝状支原体山羊亚种对山羊的致病性观察

为了观察丝状支原体山羊亚种对山羊的致病性,利用丝状支原体山羊亚种Mm1901株培养物经鼻腔和气管感染山羊,观察山羊临床表现、剖检病变、血液学变化、组织病理和病原组织器官分布等疾病指征。攻毒结束后第2天,山羊表现出明显的急性感染症状,并在第3天出现死亡或濒临死亡。剖检见多组织器官出现水肿、淤血、出血等病理变化,血常规检测提示急性细菌性炎症,病理切片主要表现为多组织器官炎性细胞浸润,肾脏玻璃样变、空泡变性等变化。通过病原分离和荧光定量PCR(qPCR),可从多组织器官中检测到病原。结果表明,丝状支原体山羊亚种人工感染可导致山羊全身多器官和组织系统性病变,是一种可导致系统性感染的病原,为我国羊支原体肺炎病原学研究积累了数据。     

国内部分地区羊支原体肺炎血清学调查及分析

为了解国内羊肺炎支原体的流行情况,本研究应用正向间接血凝试验(IHA)对2014年~2015年间采自我国12个省44个市、县的3 402份未免疫血清样品进行了绵羊肺炎支原体(MO)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)抗体的检测。结果显示:MO抗体阳性率为31.92%(1 086/3 402),其中阳性率最高的省份为内蒙古76.8%(636/828),其次是河北50%(60/120)、吉林21.99%(93/423);Mccp的抗体阳性率为10.67%(363/3 402),其中阳性率最高省份为河南35.14%(39/111),其次为河北27.5%(33/120)、山东22.5%(27/120);另有来自河北、辽宁、吉林、海南、黑龙江、内蒙古和安徽7省份的少量血清样品同时检测出MO和Mccp两种抗体,表明该病的流行存在不同菌株混合感染的情况,这在河北地区最为严重(15%)。分析表明,羊支原体肺炎在我国大部分地区流行相当严重,尤其在河北、河南和山东等集约化舍饲养殖发展的地区。绵羊的抗体阳性率明显高于山羊,表明MO在致病性和感染性方面相对Mccp更强。本研究为评估羊支原体肺炎在我国的流行状况以及制定有效防制措施提供了实验依据。