电脉冲与化学激活联合处理对猪卵母细胞孤雌发育的影响

探讨了猪卵母细胞电激活后间隔不同时间用化学药物处理对猪卵母细胞孤雌发育的影响。结果表明 :1)电激活后间隔 0 ,3,4 ,5和 6h再分别用 6 二甲基氨基嘌呤 ( 6 Dimethylaminopurine ,6 DMAP)、放线菌酮 (cyclohex imide ,CHX)处理 6h ,各组卵裂率、囊胚细胞数差异不显著 (P >0 0 5 ) ,但在 6 DMAP组中对照组囊胚率极显著高于其余各组 (P <0 0 1) ,在CHX组中对照组囊胚率极显著高于间隔 5和 6h组 (P <0 0 1) ,而其余各组之间差异不显著 (P >0 0 5 ) ;2 )电激活后间隔 4h再分别用 6 DMAP ,CHX和细胞松弛素B(CytochalasinB ,CB) + 6 DMAP处理 6h ,各组卵裂率差异不显著 (P >0 0 5 ) ,对照组囊胚率极显著高于其余各组 (P <0 0 1) ,其余各组囊胚率显著性均无差异 (P >0 0 5 )。对照组中无单倍体囊胚 ,二倍体囊胚为 88 2 4 % ,但 6 DMAP ,CHX ,CB + 6 DMAP中产生的囊胚大部分是单倍体 ,且三者之间无显著性差异 (P >0 0 5 )。以上结果说明 ,猪卵母细胞电激活后间隔一段时间再用DMAP和CHX激活 ,激活作用随时间的延长而减弱 ;猪卵母细胞电激活后 4h再用 6 DMAP ,CHX ,CB + 6 DMAP激活 ,产生的囊胚大部分为单倍体 ,该方法适于猪卵母细胞ICSI的激活。     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

利用渗透压研究猪卵母细胞发育过程中核迁移规律

本研究采用高渗操作液(氯化钠)处理体外成熟卵母细胞。结果表明,发现培养42 h的卵母细胞,中期核与第一极体刚开始分离。培养44 h的卵母细胞,中期核与第一极体已经分离,达到15°。培养46 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达45°。培养48 h的卵母细胞,中期核与第一极体之间的角度达到近90°,中期核开始向卵母细胞中迁移。经过高渗处理的卵母细胞经过后续操作后可以得到克隆个体。结果表明,利用体外成熟培养42~44 h的卵母细胞进行去核操作,可以达到近100%的去核效率,而不会影响胚胎的正常发育。     

猪卵母细胞体外受精影响因素的研究

探讨了m TBM中咖啡因浓度、精子上浮时间和精卵孵育时间对猪卵母细胞体外受精胚胎早期发育的影响。结果表明:咖啡因的添加浓度对猪卵母细胞体外受精胚胎的囊胚率无显著影响,但添加3 mmol/L咖啡因组的精子入卵率显著高于添加5 mmol/L咖啡因组和未添加咖啡因组的(P<0.05);随着精子上浮时间的延长,受精卵卵裂率和囊胚率均呈先上升后下降的趋势,上浮1.0 h组的卵裂率和囊胚率显著高于上浮1.5 h组和2.0 h组的(P<0.05);精卵共孵育时间对精子入卵率无显著影响,但受精9 h处理组的囊胚率显著低于受精3 h组和6 h组的。     

水貂卵母细胞发育过程中脂滴的形态学及组织化学变化的研究

应用电镜及光镜组织化学技术,对水貂卵巢內各发育阶段卵母细胞中的脂滴进行了研究。在水貂卵母细胞中,脂滴的形成是卵母细胞生长开始的标志之一。在生长早期,卵母细胞中脂滴分散在皮质与核之间的胞质中,且脂滴的染色较深,在晚期阶段,脂滴明显增大,聚集到一起,染色变浅。经油红O和酸性氧化苏木素染色证明,在卵泡腔形成之前,脂滴主要是由中性脂肪和磷脂组成,在卵泡腔形成之后,脂滴成分主要是中性脂肪,磷脂消失。实验结果表明,脂滴可能是来自于相对静止期卵母细胞中分布的黑色嗜锇颗粒(直径约0.38μm),经过脂质的不断蓄积而形成脂滴。脂滴量特别多是水貂成熟卵母细胞的特点之一。     

猪卵母细胞体外受精影响因素的研究

探讨了m TBM中咖啡因浓度、精子上浮时间和精卵孵育时间对猪卵母细胞体外受精胚胎早期发育的影响。结果表明:咖啡因的添加浓度对猪卵母细胞体外受精胚胎的囊胚率无显著影响,但添加3 mmol/L咖啡因组的精子入卵率显著高于添加5 mmol/L咖啡因组和未添加咖啡因组的(P0.05);随着精子上浮时间的延长,受精卵卵裂率和囊胚率均呈先上升后下降的趋势,上浮1.0 h组的卵裂率和囊胚率显著高于上浮1.5 h组和2.0 h组的(P0.05);精卵共孵育时间对精子入卵率无显著影响,但受精9 h处理组的囊胚率显著低于受精3 h组和6 h组的。     

绵羊卵巢运输、保存温度及时间对其卵母细胞孤雌发育能力的影响

为研究绵羊卵巢不同运输温度、保存温度及时间对其卵母细胞孤雌发育能力的影响,将采集卵巢随机分别置于(10～15),(20～25),(30～35)℃3种不同温度生理盐水中运输到实验室培养,然后优选较好运输温度将采回卵巢随机分为3个试验组,分别保存在4,(14～18),(25～30)℃生理盐水中,保存15～17h后进行成熟培养并孤雌激活。结果表明:(1)在不同运输温度的卵母细胞中,温度为20～25℃时卵母细胞能够进行最好的发育,其成熟率和囊胚率分别为67.44%,35.93%;(2)将绵羊卵巢在14～18℃保存15～17h,对卵母细胞的成熟率(61.81%)、孤雌激活后囊胚的发育率(29.03%)均无显著影响,而将卵巢保存在4℃或25～30℃却显著降低了卵母细胞的成熟率(41.90%,18.40%)与卵裂率(9.09%,13.04%),没有发育到囊胚。从而得出,绵羊卵巢卵母细胞体外培养的长距离运输适宜温度为20～25℃。卵巢在14～18℃保存过夜,不影响卵母细胞的发育能力。     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞体外发育能力的影响

采用猪未成熟(GV期)和体外成熟(MⅡ期)卵母细胞分组进行冷冻保护剂毒性试验,试验组经冷冻液处理,对照组不用冷冻液处理。结果表明,GV期与MⅡ期卵母细胞相比,两者经冷冻保护剂处理后,其存活率、体外受精胚卵裂率均无显著差异(P>0.05);试验组GV期卵母细胞存活率、体外成熟率及体外受精胚卵裂率虽略低于对照组(85.9%,72.4%和50.9%对91.3%,73.9%和53.3%),但差异不显著(P>0.05);试验组MⅡ期卵母细胞存活率虽显著低于对照组,但卵裂率与对照组无显著差异(P>0.05)。表明所用冷冻液及其处理程序,对卵母细胞无明显毒性。分3组对猪卵母细胞进行冷冻保存试验:I组为对照组;II组为GV期卵母细胞冷冻组;III组为MⅡ期卵母细胞冷冻组。结果表明,经开放式拉管(Open pulled straw,OPS)法玻璃化冷冻后,GV期和MⅡ期卵母细胞均获得较高的形态正常率,但GV期卵母细胞冷冻后存活率要显著高于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。经玻璃化冷冻后,GV期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均明显低于新鲜卵母细胞(42.6%和7.79%对73.9%和53.3%,P<0.05),MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后未获得卵裂。在GV期卵母细胞冷冻组,154枚卵母细胞冷冻后经体外成熟、体外受精及体外培养,共有12枚发生卵裂,其中6枚发育至8-细胞,3枚发育至16-细胞,3枚发育至桑椹胚。本研究表明,所用冷冻方案更适合于猪GV期卵母细胞的冷冻保存。     

猪卵母细胞室温保存与成熟培养

猪卵母细胞在TCM—199培养基中,20℃和37℃(对照)下,分别培养24h和48h。培养基中加入20%混合的3个犊牛血清、5%的猪卵泡液。气体浓度为90%N_2,5.2%O_2和4.8%CO_2。24h,20℃和37℃培养的卵母细胞经台盘蓝鉴别后,存活率分别为71%和69%。当培养到48h,20℃组的成活率明显高于37℃组,分别为61%和25%。电镜观察,20℃组卵母细胞的线粒体较完整,微绒毛较多。而37℃组则相反。当20℃培养24h 后,把卵母细胞移到37℃下继续培养24h,仍有45%的存活率,11%的颗粒细胞扩散程度较好。染色后,可见第1极体和染色体,说明处于第2次成熟分裂的中期。实验说明,20℃保存24h 仍有继续发育成熟的潜力。     

促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响

在成熟液中同时添加不同浓度(0.25～2.0μg/mL)FSH和不同浓度(0.25～2.0μg/mL)LH,探讨这2种促性腺激素结合使用对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,当FSH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL及LH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL时,猪卵母细胞的核成熟率极显著高于没有添加FSH和LH的对照组(P<0.01),而FSH和LH不同浓度组合之间对猪卵母细胞核成熟影响差异不显著(P>0.05)。结果表明,成熟液中同时添加0.25μg/mLFSH和0.25μg/mLLH便能极显著地促进猪卵母细胞的核成熟率,国产FSH和LH用于猪卵母细胞体外成熟研究是可行的。     

促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响

在成熟液中同时添加不同浓度(0.25～2.0μg/mL)FSH和不同浓度(0.25～2.0μg/mL)LH,探讨这2种促性腺激素结合使用对猪卵母细胞体外成熟的影响.结果显示,当FSH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL及LH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL时,猪卵母细胞的核成熟率极显著高于没有添加FSH和LH的对照组(P＜0.01),而FSH和LH不同浓度组合之间对猪卵母细胞核成熟影响差异不显著(P＞0.05).结果表明,成熟液中同时添加0.25μg/mL FSH和0.25μg/mL LH便能极显著地促进猪卵母细胞的核成熟率,国产FSH和LH用于猪卵母细胞体外成熟研究是可行的.     

猪卵巢卵母细胞体外成熟与体外受精的研究

 自屠宰场取猪卵巢825个，得卵母细胞8346个，将其分为3类。分类后卵母细胞在含有pFF或PMSG的TCM-199培养液中于5%CO#-2、95%空气、饱和湿度、39℃下培养36小时。成熟卵母细胞用前培养法加肝素或咖啡因获能的鲜精，以2×10#+5/ml的精子密度体外受精。在授精12-17小时以后，一些受精卵以手术法移至受体母猪输卵管中，另一些则更换BMOC-2培养液继续体外培养。3类卵母细胞间的成熟率与卵裂率有明显的差异。成熟培养液中加入PMSG和pFF，可明显提高卵母细胞成熟率（67.7%:17.8%）和桑椹胚率（6.5%∶2.8%）用笔者的培养液，有些胚胎成功地越过4细胞阻断而获得了猪的纯体外培养桑椹胚（1990.5）。移入受精卵的9头母猪，有3头妊娠，其中1头于1990年9月产5头仔猪。离子测定结果显示不同离子（Na、Ca、Cl、K）在精子某些部分、卵母细胞和受精卵的表面分布有明显改变。RMP检测指出培养前A类和部分B类卵母细胞为负值，C类和剩余部分B类为正值。培养后不同时间3类卵母细胞RMP差异明显，说明其代谢水平强弱不一。受精后皆为负值，说明物质代谢比受精前更为活跃。     

外源激素和眼柄提取物对罗氏沼虾卵母细胞的离体诱导作用

使用四种类固醇激素，两种保幼激素类似物和眼柄提取物进行罗氏沼虾离体卵巢小块培育，于２５℃培育２４ｈ后切片并进行光谱观察。发现１７α－羟孕酮，孕酮和ＪＨＡ－ＺＲ５１５对卵黄发生前期卵黄发生期卵母细胞卵径增大均有极显著刺激作用。高浓度雌二醇对卵黄发生前期卵母细胞卵径增大也有明显刺激作用；高浓度ＪＨＡ－ＺＲ５１２对成熟前卵巢卵母细胞卵径增大有显著作用，蜕皮激素对卵径增大无作用。眼柄提取物对卵黄发生期卵母     

外源激素和眼柄提取物对罗氏沼虾卵母细胞的离体诱导作用

使用四种类固醇激素，两种保幼激素类似物和眼柄提取物进行罗氏沼虾离体卵巢小块培育，于２５℃培育２４ｈ后切片并进行光谱观察。发现１７α－羟孕酮，孕酮和ＪＨＡ－ＺＲ５１５对卵黄发生前期卵黄发生期卵母细胞卵径增大均有极显著刺激作用。高浓度雌二醇对卵黄发生前期卵母细胞卵径增大也有明显刺激作用；高浓度ＪＨＡ－ＺＲ５１２对成熟前卵巢卵母细胞卵径增大有显著作用，蜕皮激素对卵径增大无作用。眼柄提取物对卵黄发生期卵母     

猪卵母细胞体外发育不同时期膜电位的研究

采用细胞内微电极记录方法，观察了猪卵母细胞体外发育不同时期膜电位的变化．卵母细胞在体外发育０ｈ膜电位为－８．９７±０．５ｍＶ；体外成熟发育１８ｈ膜电位为－４６．４０±１．７ｍＶ；２４ｈ膜电位为＋１０．６０±１．０ｍＶ；３６ｈ膜电位为＋２６．５０±１．０ｍＶ；５０ｈ膜电位为＋２６．４０±１．１ｍＶ；体外受精发育３０ｈ膜电位为－４０．５０±０．１ｍＶ．并据他人电镜观察结果，对卵母细胞体外发育不同时期膜电位与其代谢的关系进行了初步探讨，发现两者间具有显著的相关性．     

牛老化卵体外受精后的胚胎发育速度与细胞遗传学研究

体外成熟培养和牛老化卵受精后发育到囊胚到期速度减慢。囊胚期的发育率分别为22h培养组的35．3％,34h组23．6％,46h组15．4％,胚胎的发育速度随培养时间的延长而明显减慢（P＜0．05）。46h组的囊胚期胚胎的平均卵裂球数明显少于22h组（P＜0．05）,老化组的染色体平均分裂像,分裂指数均明显低于对照组（P＜0．05）。染色体异常发生率46h组高于22h组。     

水稻成熟胚组培过程中胚乳影响的研究

水稻成熟种子在组织培养过程中受着其所带胚乳量的影响。种子的胚乳量愈少，则始愈期愈早，愈伤组织的胚性愈强，分化率愈高；反之，种子所带的胚乳量愈多，则始愈期推迟，愈伤组织的出愈速度，早期愈伤组织生长速度愈愉，但后期愈伤组织的生长速度下降得愈快，受胚乳代谢列垢毒害愈强，愈伤组织的分化度愈弱。     

猪卵泡卵母细胞体外受精研究

采用３种获能方法（常规获能法、肝索获能法、钙离子载体获能法）进行猪冷冻附睾精子的体外获能研究，其相应的受精率分别为４２．５％，３２．０％，３０．８％，卵裂率分别为１８．６％，１５．７％，１６．１％。受精率、卵裂率间均无显著差异。精子与ＳＭＴ－ＰＧＨ基因质粒混合培养后引起卵裂率下降，实验组的卵裂率（７．５％）显著地低于对照组的水平（２１．０％）．３９℃与３７℃下受精，其受精率分别为３８．８％。１８．７％；多精受精率分别为８９％，３０．７％；卵裂率分别为２６．９％，３．７％，３９℃组的受用率、卵裂率均显著高于３７℃组水平，而多精受精率则极显著地低于３７℃组。发育培养液Ａ液、Ｂ液中的卵裂率分别为２４．３％，１３．０％，两者无差异。在兔输卵管内培养猪体外受精卵，卵裂率为４６．７％，极显著地高于对照组水平（１０．９％）．受精卵体外培养１６～１７ｈ后离心，可观察到１８．４％的原核形成率，这与受精卵体外培养的卵裂率（１９．５％）相当。