大肠杆菌热敏毒素研究概况

本文在分析大肠杆菌热敏毒素（LT）生物学特性及其分子学水平研究的基础上，从蛋白质和基因水平阐述了猪源LT与人源LT的亲缘关系，评述了LT在研制人畜大肠杆菌腹泻疫苗中的应用价值，也通过对与LT具有相似蛋白和基因结构的霍乱毒素CT的分析，表明二者具有相同的进化起源，认为通过定点诱变的LT能够取代CT用作幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂。     

大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望

大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统.但由于大肠杆菌表达系统所表达的蛋白常常形成无活性的包涵体,为此研究者摸索出许多用来提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法,近年来在提高重组蛋白可溶性表达的策略方面取得了一定进展,现介绍如下.     

白喉毒素DAB389-aMSH重组毒素的构建及表达

摘要:利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有aMSH全序列作下游引物,以pET28a/DAB389-EGF为模板,PCR扩增DAB389-aMSH基因片段,用限制性内切酶EcoR I和Nco I酶切,并插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建了重组表达载体pET28a/DAB389-aMSH,在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389 -aMSH,转化菌经1mmol/L IPTG、30C诱导5h,用SDS-PAGE 和Western blot 鉴定表达的重组毒素质。结果表明扩增的片段与理论值一致。重组质粒的DNA序列分析正确。SDS-PAGE表明,重组毒素相对分子量为43.76KD,且表达量达菌体总蛋白量的31.6%左右。Western blot分析显示,重组毒素能特异性地与抗白喉抗体结合,表明已成功构建表达了重组DAB389-aMSH的工程菌株,表达产物具有生物学活性。     

产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体大肠杆菌表达条件的优化

为优化产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达条件,以前期构建的产气荚膜梭菌ε毒素重组突变体为基础,通过控制变量法确定诱导温度、诱导时间、IPTG诱导浓度以及诱导时菌液浓度等原核蛋白表达条件.结果表明,ε 毒素的重组突变体在37℃、菌液OD600值为0.895～1.295,1.6 mM IPTG诱导6 h条件下可溶性表达量最高...     

鸡致病性大肠杆菌O1、O2和O78的I型菌毛结构基因表达载体的构建及表达产物的检测

用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78，分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段，再将载体pET-28a( )用SacI和BamHI双酶切，最后将pET-28a( )DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78。重组菌株BL21（DE3），（pETFimO1)、BL21（DE3）（pETFimO2)和BL21（DE3）（pETFimO78)经IPTG诱导后，其表达产物经SDS－PAGE检测，结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌I型菌毛蛋白。     

LTβR基因在大肠杆菌F18抗性型和敏感型苏太仔猪间的差异表达分析

旨在探讨LTβR基因在苏太断奶仔猪各组织间的mRNA表达谱,并比较分析该基因在大肠杆菌F18抗性/敏感型群体间的表达差异,为进一步探讨该基因的功能及筛选断奶仔猪大肠杆菌F18抗性遗传标记提供一定的指导和依据。试验分别挑选35日龄大肠杆菌F18抗性/敏感型苏太断奶仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法比较分析LTβR基因在11个组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠)间的表达差异。结果:LTβR基因在检测的11个组织中均有表达,其中在肝、肺、肾、胃、十二指肠和空肠呈现高水平表达,在脾和淋巴结中呈现中等水平表达,在心脏、肌肉和胸腺组织中呈现低水平表达。除肝脏外,LTβR基因在抗性型个体中表达量普遍高于敏感型个体,而且在肠系膜淋巴结中的表达量极显著高于敏感型个体(P0.01)。由此推测,LTβR基因的表达上调有利于断奶仔猪抵御大肠杆菌F18的感染,且可能是通过在淋巴结组织中的高表达维持和提高了肠道的免疫水平,从而提高了断奶仔猪抵御大肠杆菌F18感染的能力。     

白喉毒素DAB_(389)-αMSH重组毒素的构建及表达

利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有αMSH全序列作下游引物,以pET28a/DAB389-EGF为模板,PCR扩增DAB389-αMSH基因片段,用限制性内切酶EcoR I和NcoI酶切,并插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建了重组表达载体pET28a/DAB389-αMSH,在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389-αMSH,转化菌经1 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组毒素。结果表明扩增的片段与理论值一致,重组质粒的DNA序列分析正确;SDS-PAGE表明重组毒素相对分子量为43.76 KD,且表达量达菌体总蛋白量的31.6%。Western blot分析显示,重组毒素能特异性地与抗白喉抗体结合,表明已成功构建表达了重组DAB389-αMSH的工程菌株,并获得表达蛋白。     

鸡致病性大肠杆菌O1、O2和O78的Ⅰ型菌毛结构基因表达载体的构建及表达产物的检测

用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78,分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段,再将载体pET-28a(+)用SacI和BamHI双酶切,最后将pET-28a(+)DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接,转化至受体菌BL21(DE3)中,经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78.重组菌株BL21(DE3) (pETFimO1)、BL21(DE3)(pETFimO2)和BL21(DE3)(pETFimO78)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白.     

产志贺毒素样大肠杆菌F18ab菌毛操纵子基因的体外非诱导系统的表达和鉴定

以产志贺毒素样大肠杆菌（SLTEC）F18ab血清型标准菌株107/86基因组DNA为模板,利用PCR技术成功扩增出编码F18ab完整菌毛操纵子fed基因,克隆入表达载体pBR322,经限制性内切酶酶切分析,DNA琼脂糖电泳鉴定并结合序列测定分析,构建和筛选出含fed完整基因正确插入的pBR322-fed重组质粒,将上述重组质粒转化至不含任何菌毛结构的大肠杆菌SE5000,该表达重组菌能分别与兔抗F18ab亚单位蛋白FedF高免血清、鼠抗F18ab菌毛a单因子单克隆抗体、兔抗F18ab菌毛高免血清和抗F18ab菌毛IgG抗体产生明显的凝集反应。用热抽提法分别抽提和纯化SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）体外表达的F18ab菌毛,纯化菌毛经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色获单一相对分子质量约为15 000蛋白条带。Western-blotting结果表明：兔抗F18ab菌毛高免血清能特异性识别SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）所提纯的单一主要结构蛋白。用重组菌SE5000（pBR322-fed）进行易感仔猪小肠上皮细胞体外黏附试验和黏附抑制试验,结果表明：重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86一样具有较强的黏附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而兔抗F18ab菌毛高免血清能有效地抑制上述重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86对易感仔猪小肠上皮细胞的黏附结合。     

出血性大肠杆菌O157eae-stx1/2B融合基因的构建和表达

构建表达eae和stx1／2B的融合基因，克隆eae基因的C端280个氨基酸残基(Int280)基因部分，以正确地阅读框定向插入到含有stx1／2B融合基因的质粒，构建重组质粒，将其转化于BL21(DE3)，用IPTG进行诱导表达，经SDS—PAGE电泳检测，该融合蛋白获得了高效表达。薄层扫描分析表明：目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的50．67％。由于该融合蛋白由eae、stx1B、stx2B等三部分抗原组成，可刺激机体产生针对紧密素和StxB的抗体，在EHEC O157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的定点突变及其真核表达载体的构建

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计并合成引物,采用重叠延伸PCR(splice overlap extension PCR,SOE-PCR)定点诱变技术对ORF2基因进行定点突变。DNA测序结果表明,ORF2基因片段的372—378 bp处的碱基由TCTAGAT突变为ATTGGAT,从而破坏酶切位点XbaⅠ,成功获得ORF2的突变基因片段。进而将其连接到腺病毒真核表达载体pAD5-Blue中,成功构建真核表达载体,并获得PCV2的Cap蛋白表达产物,为PCV2新型疫苗研究奠定了重要基础。     

实时荧光定量PCR检测PrP基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

对金黄地鼠P rP基因序列进行分析,选择其高度保守区域设计引物,对金黄地鼠各组织提取mRNA,经RT-PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明P rP基因保守区段已经成功克隆。将107~102拷贝/反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,10次重复C t值平均分别为17.50±0.5、21.38±0.2、25.29±0.7、29.12±0.7、31.34±0.4、33.89±0.1,系统自动分析软件显示C t值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.998。对动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,该标准曲线的灵敏度为102拷贝/反应。荧光PCR P rP基因表达检测标准品质粒和标准曲线的建立,为检测P rP基因的组织特异性表达和动物传染性海绵状脑病发生的分子机理奠定了基础。     

猪MSTN前肽定点诱变载体在C2C12细胞中的表达

本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性.以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序.再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上.通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞.转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况.结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高.这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料.     

丝状支原体丝状亚种SC型脂蛋白Q的N末端定点突变及表达载体的构建

根据已发表的丝状支原体丝状亚种SC型（MmmSC）LppQ基因序列设计引物，从MmmSC HVRIx株中扩增出了LppQN末端基因，并将其分别克隆到pUC18和pUC19上，利用一步重叠延伸PCR突变方法将其66位的TGA突变为TGG，经克隆与序列测定证实突变成功后，将已突变的LppQN末端基因插入原核表达载体pET32a的多克隆位点，成功地构建了LppQN末端基因原核表达载体pET32a-LppQ，为其下一步体外表达奠定了基础。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

湖羊MyoG基因CDS的克隆及其真核表达载体的构建

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表明:成功克隆了湖羊MyoG基因的CDS,在离体细胞中MyoG基因发生了转录,这为进一步研究MyoG基因的体内外表达及生物学的活性奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒P1-2A基因重组杆状病毒的构建及其表达

设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBac^TM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。     

蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建及其在牛乳腺中的表达

将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,转染泌乳期奶牛乳腺小叶并获得暂时表达。利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。进而用病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺小叶组织,产后奶样经FAPA法检测表明蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织,并能实现相对稳定的表达。     

猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建

根据GenBank中收录的猪白细胞介素2(pIL-2)基因序列,设计1对特异性引物.运用RT-PCR技术从刀豆素(Con A)诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到pIL-2基因,并将其克隆至pGEM-T Easy栽体上.核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长493 bp,含465 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,与已知pIL-2核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达100%.将克隆的pIL-2基因编码阅读框亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV,电转化含腺病毒基因组(pAdEasy-1)的大肠埃希茵细胞BJ5183-AD-1,成功获得了重组腺病毒DNA,将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD-293细胞,经过病毒基因组的PCR鉴定和转录水平的RT-PCR鉴定,初步表明,获得了表达pIL-2的重组腺病毒.