含GFP报告基因的伪狂犬病病毒上海株gE-gI基因部分缺失株的构建

在伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上，进一步构建了转移载体质粒，为PRV－SH的gE－gI基因部分缺失毒株的构建作准备，将gI和gE基因克隆入pUC18中构建pgEI载体，利用gE基因中的酶切位点缺失掉gE基因5′端363bp，并把录色荧光蛋白（GFP）基因表达盒插入到缺失部分。通过酶切鉴定，表明GFP基因已3插入到pgEI中，构建了含GFP的缺失转移载体pgEI-GFP。用DOTAP试剂将pgEI-GFP转染感染了PRV－SH株的兔肾（RK）细胞，待出现80％以上的细胞病变时收获病毒，并以GFP为标志，通过蚀斑法得到纯化重组病毒，命名为PFDE／DI。     

表达外源绿荧光蛋白重组山羊痘病毒的构建及纯化

以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒 (Goatpox virus，GPV) 疫苗株为亲本，以复制非必需胸苷激酶 (tk) 基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂。利用转移载体pTK-lacZ-gfp及其与GPV发生同源重组获得的病毒(rGPV-lacZ-gfp) 验证外源基因β-半乳糖苷酶 (lacZ) 和绿荧光蛋白 (gfp) 基因在背靠背启动子p11和p7.5启动下成功稳定表达后，将转移载体lacZ基因更换为gpt (黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶) 基因 (pTK-gpt-gfp)，利用MPA阻断核酸代谢途径筛选并获得了遗传稳定表达的单一纯化病毒克隆 (rGPV-gpt-gfp)。研究建立了表达外源基因重组GPV构建系统及其克隆纯化方法，为进一步开展GPV活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。     

布鲁氏菌M5-90疫苗株磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm)突变株的构建及免疫评价

为获得可以区分自然感染和疫苗免疫且毒力较弱的布鲁氏菌候选疫苗株,本实验研究了磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm)对布鲁氏菌(Brucella melitensis)M5-90疫苗株毒力的影响,并对其进行了免疫评价。本实验构建了重组质粒pGEM-7zf-Δpgm,电转化布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选获得布鲁氏菌疫苗株M5-90的pgm基因缺失株(Δpgm),并对获得的M5-90 Δpgm株进行遗传稳定性、免疫原性检测。结果显示,Δpgm能稳定传15代;Δpgm组的抗体含量较亲本株M5-90组差异不显著;Δpgm在诱导机体产生IL-2的能力要强于M5-90,产生INF-γ的能力低于M5-90;该基因缺失株采用虎红平板凝集试验和试管凝集试验不发生凝集反应;Western blot证实,Δpgm不能诱导小鼠产生抗pgm蛋白的抗体。本研究构建的Δpgm具有很好的遗传稳定性和免疫原性,为研制布鲁氏菌基因缺失疫苗提供了实验依据。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失毒素1激活基因C(ApxIC)同时嵌合副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2基因(ompP2)复合突变株的构建

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)以及副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)是引起猪发病的2种病菌。本研究以APP血清5型分离株(SW1)为基础材料,通过构建重组转移载体pBOSKΔIC-1和pBOSKΔIC/ompP2,构成卡那霉素抗性基因(Kanr)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的果聚蔗糖酶基因(sacB)的正负双向筛选表达盒,并筛选获得SW1株缺失毒素I的激活基因C(ApxIC),同时嵌合Hps外膜蛋白P2基因(ompP2)的复合突变株SW1ΔApxIC/ompP2。该突变株经鉴定,与SW1亲本株相比,其缺失了大小为475bp的apxIC基因,同时嵌合有大小为1107bp的Hps ompP2基因,其基本生长特性与亲本株(SW1)没有显著区别;同时在体外,连续传代10代之后缺失的apxIC基因不会发生回复突变,嵌入的ompP2基因仍能够稳定遗传。本研究成功构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失apxIC基因并嵌合有Hps ompP2基因复合突变株,为今后研究APP和Hps新型二联疫苗打下基础。     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。     

鱼源嗜水气单胞菌aopB-/aopD-/aroA-缺失株的构建及鉴定

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)能引起多种鱼类暴发性出血性败血症,为研制更加安全的嗜水气单胞菌口服活疫苗,构建了鱼源嗜水气单胞菌aopB-/aopD-/aroA-缺失株。首先构建含缺失369 bp的aopB/aopD基因(编码嗜水气单胞菌外膜蛋白B、D)与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒pREaopB/aopD,与嗜水气单胞菌Ah2056接合转移,应用二步法筛选aopB-/aopD-缺失株,PCR证实aopB/aopD基因的缺失突变。在此基础上,构建另一个含缺失1 290 bp的aroA基因(编码5-酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)与庆大霉素抗性片段（aacC1片段）的重组自杀性质粒pSUParoA,与aopB-/aopD-缺失株接合转移,利用庆大霉素抗性筛选aopB-/aopD-/aroA-缺失株,用PCR证实aroA基因的缺失突变。进一步对aopB-/aopD--/aroA-缺失株进行生长特性、对鱼的毒力等生物学特性鉴定。结果表明,aopB-/aopD-/aroA-缺失株构建成功,且该缺失株为毒力丧失、营养缺陷株。     

河南隐孢子虫分离株的系统发生

以线粒体功能性蛋白替代氧化酶(alternative oxidase,AOX)为研究对象,对隐孢子虫(Cryptosporidium)分离株进行扩增和测序,并对测得的序列进行种系发育关系研究,以确定不同隐孢子虫分离株之间的进化关系,并以18SrRNA和HSP70基因构建的进化树作参照,评价AOX基因是否适合作隐孢子虫基因分型和进化关系分析的基因座。结果表明,在AOX序列构建的进化树上Cryptosporidum分为两大类:Cryptosporidium baileyi和C.meleagridis处于一个进化枝上,C.hominis、C.suis、C.parvum牛基因型和C.parvum鼠基因型处于另一个进化枝上。在C.parvum内,鼠基因型分离株和猪基因I型(即C.suis)分离株与牛基因型和人基因型(即C.hominis)在AOX基因序列上都存在着差异。鹌鹑源C.meleagridis分离株与禽源C.baileyi3个分离株在AOX基因序列的同源性显著高于前者与C.parvum的同源性,在进化树上C.meleagridis与C.baileyi的亲缘关系也较其与C.parvum密切。AOX基因不仅可作为隐孢子虫分离株种系发育的遗传标记,又为发现隐孢子虫新的遗传特性提供了一种途径。     

传染性胃肠炎病毒(TGEV)双启动子真核表达载体pVAXD-N/S的构建与鉴定

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的高度接触性传染病.TGEV的S、N基因具有重要的免疫学功能,构建S、N双基因疫苗将能提供更好的免疫效果.本研究用RT-PCR扩增S基因抗原区(2.1 kb,含A、B、C和D完整的抗原位点)和N基因编码区(1.2 kb),分别定向插入双启动子真核表达载体pVAXD的多克隆位点(MCS),构建了单价质粒pVAXD-N和pVAXD-S,然后将N基因插入pVAXD-S中,构建了双启动子真核表达质粒pVAXD-N/S.将pVAXD-N/S与对照组(pVAXD-N、pVAXD-S和pVAXD)转染COS-7细胞进行表达鉴定,用RT-PCR可从pVAXD-N/S转染细胞中扩增出s、N两个目的基因,IFA鉴定结果显示,pvAXD-N/S可同时表达S、N两种目的蛋白.初步的小鼠(Mus musculus)免疫试验结果显示,pVAXD-N/S免疫小鼠后第14天即可检测到抗TGEV的IgG抗体,第35天抗体达最高峰,pVAXD-N/S诱导的抗体水平显著高于单基因质粒组pVAXD-N和pVAXD-S的抗体水平(P＞0.5),与混合质粒(pVAXD-N+pVAXD-S)诱导的抗体水平相当.本研究结果表明,构建的双启动子表达载体pV AXD-N/S具有S、N基因的双重免疫功能,为TGEV新型双基因疫苗研究提供了基础材料.     

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）广西流行株3＇端非编码区序列分析

本研究应用RT-PCR方法扩增出分离自广西的26株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）以及参考株M41和疫苗株H120、Ma5和4/91的3＇端非编码区（3＇UTR）的cDNA,并对其进行了克隆、序列测定、比较及其系统进化分析。序列分析结果表明,与Beaudette株的3＇UTR序列相比较,26株分离的IBV中有1株和3株的分离株3＇UTR序列分别插入了23个和2个碱基,另外有12株、6株、1株、2株和1株的分离株3＇UTR序列分别缺失了1个、2个、22个、29个和84个碱基,不同毒株之间碱基数量最大相差达107个碱基。系统进化分析结果表明,26株分离株可分为4群,其中21株属于第Ⅰ群,与经典疫苗株H120的核苷酸同源性均较低（54.4%～75.5%）;3株与4/91同属于第Ⅱ群;1株与H120同属于第Ⅲ群;另外1株单独属于Ⅴ群。综上所述,广西流行IBV的绝大部分毒株在3＇UTR序列上与目前常用的疫苗株相比都发生了很大的变异,而且存在多种形式的碱基缺失和插入现象。由此,我们认为流行株的变异可能是疫苗不能提供有效保护的主要原因。     

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因(ahyR)突变株的构建及特性分析

根据GenBank公布的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila,Ah)转录调控蛋白基因ahyR序列设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增AhJ-1株ahyR的部分片段。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kanr)基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。将鉴定为阳性的重组质粒转化嗜水气单胞菌J-1株感受态细胞,获得1突变株细菌。PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因同源突变株,命名为J-1△ahyR。与J-1株相比,突变株的外膜蛋白图谱和部分生化特性发生改变;胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素等几种主要毒力因子同时丧失;致病力明显降低,对小白鼠的半数致死量大于1.0×108CFU(colonyformingunits)。该研究为ahyR基因功能的探讨及嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。     

十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）能够产生大量的胞外多糖。胞外多糖商品名又称为黄原胶,具有广泛用途,在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原胶,我们采用转座子EZ-Tn5随机插入诱变的方法对8004菌株进行突变,获得了一株不产黄色素的突变体。通过对突变体的转座子EZ-Tn5插入位点进行分析,发现该突变体是由于编号为XC_4097的基因被插入突变后衍生而来。同源性分析表明XC_4097编码一种脂质酰基转移酶,它与脂质的合成有关。采用同源双交换方法构建XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成,而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。     

利用GFP基因的黄瓜T-DNA插入突变体构建与快速鉴定

为促进黄瓜功能基因组学研究,本研究开展了黄瓜T-DNA插入突变体快速构建与鉴定方法的研究.基于对黄瓜遗传转化体系农杆菌侵染活力和共培养条件的优化,本研究以绿色荧光蛋白GFP基因为插入片段,进行黄瓜T-DNA插入突变体的创制,并利用荧光显微镜进行快速鉴定,最后采用TAIL-PCR技术对突变体进行分子鉴定,确定突变位点.结...     

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。     

植物青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性的测定

根据青枯菌(Ralstonia solanacearum)与群体猝灭相关aac基因序列设计PCR引物,扩增获得了aac基因,并将基因克隆到pGEM-T- easy载体中。将庆大霉素基因插入aac基因内部,使其突变,将含有庆大霉素基因的aac突变基因亚克隆进入自杀质粒pDS132中,构建成aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm。将自杀质粒电转化至青枯菌GMI 1000菌株中,通过体内同源重组,置换其野生型的aac基因。通过三步筛选法和PCR扩增鉴定,筛选获得了具有庆大霉素抗性的青枯菌aac基因突变株(GMI 1000-m)。接种番茄结果显示,青枯菌aac突变株的致病性较野生型GMI 1000明显下降。证明aac基因在青枯菌致病过程中具有重要作用。     

阴沟肠杆菌B29菌株脂多糖合成基因（waaL,waaG）缺失突变株的构建及分析

脂多糖（LPS）在革兰氏阴性细菌中的功能作用在不同菌株中已有研究,但尚未有对肠杆菌属LPS结构与功能的报道。本研究试图构建能引起肥胖的阴沟肠杆菌B29菌株waaL和waaG基因的缺失突变株,以了解突变体菌株产生的LPS结构与活性与野生菌株产生的LPS的差异。根据同源重组技术原理,利用广宿主自杀性质粒构建成敲除载体pKNG101△waaL和pKNG101△waaG,转化E.coli SM10菌株,并与B29菌株进行双亲杂交,再以抗生素和蔗糖筛选条件筛选waaL和waaG基因缺失突变株;利用多重PCR、ERICPCR、PCR-DGGE、DNA测序结果均证实突变株B29△waaL和B29△waaG构建成功;最后,对野生菌株B29与两个突变株生物学特性的差异进行了比较。银染实验结果表明野生型B29菌株的脂多糖为光滑型结构,突变株的LPS结构明显缺失O抗原,B29△waaG突变株同时还缺失了外部核心部分;用鲎试剂法检测LPS的内毒素活性显示,突变株的内毒素活性与野生型相比有较大幅度下降;B29△waaL突变株的生长速率与野生型相当,而B29△waaG突变株的生长速率则相对降低。本研究成功构建两种内毒素活性下降的突变株,为下一步利用突变株研究B29菌株在肥胖发生中的机制奠定基础。     

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白

本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖 (G) 蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL株G蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9 细胞中, 分离出2 个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA) 从重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf9 细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL株感染NA 细胞的G蛋白的分子量一致。35 个抗RC HL株G蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞反应, 表明表达的G蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G蛋白主要分布在Sf 9 细胞的膜表面, 形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL株感染的NA 细胞的荧光相同。