柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病（Huanglongbing,HLB）基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期（2个月）锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础,筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因,从中选3个差异表达水平较高的基因克隆,分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征;烟草亚细胞定位结果表明,Cs NAC68定位在细胞核,Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照,Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染,显著上调表达,Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染,显著上调表达;Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、J...     

茄子SmNAC1 基因的克隆与表达分析

 以茄子幼苗为试材,利用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得SmNAC1 基因全长,并利 用RT-qPCR 技术检测该基因在GA、4 ℃低温、NaCl 处理下的时空表达。结果显示：SmNAC1 全长序列 1 279 bp,开放阅读框为909 bp,编码302 个氨基酸,推测其蛋白质分子量约35.04 kD;SmNAC1 含有 NAC 家族的N 端保守域,与番茄、马铃薯同源性高达90%。SmNAC1 受GA、低温和高盐诱导,表达上 调,但在根、茎、叶中的表达量有差异,在根中表达水平整体高于茎和叶中,显示SmNAC1 在根中优势 表达,且短时间（0.5 ~ 1 h）相对表达量较高,而在茎和叶中应答相对迟缓,且叶中表达水平趋于稳定。 可见SmNAC1 可能参与了茄子对外源GA 诱导的响应及对低温、高盐胁迫的耐受调节过程。     

枳抗逆基因PtrZPT2-2 的克隆与表达分析

 通过电子克隆和RT-PCR 法从枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]中克隆到1 个C2H2 型锌指蛋 白家族基因,命名为PtrZPT2-2。该基因编码159 个氨基酸残基,预测蛋白分子量为17.28 kD,等电点为 9.51。PtrZPT2-2 包含两个C2H2 型锌指结构域,在其C–末端含有一个转录抑制结构域EAR/DLN-box （DLNL）。PtrZPT2-2 与其他植物参与各种非生物胁迫反应的C2H2 型锌指蛋白有较高的一致性。系统发 育树分析表明PtrZPT2-2 与杨树PtaZFP2,矮牵牛ZPT2-12、ZPT2-13,拟南芥ZAT12、ZAT7 亲缘关系较 近。半定量PCR 分析表明,低温、高盐、干旱胁迫和ABA 处理下枳叶、茎、根中PtrZPT2-2 均被诱导上 调。PtrZPT2-2 可能在枳适应低温、高盐、干旱等非生物胁迫和ABA 响应中起着重要作用。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

荔枝类甜蛋白基因的克隆与表达分析

以‘妃子笑’荔枝（Litchi chinenesis）为试材,通过PCR方法克隆了荔枝类甜蛋白基因LcTLP（登录号JF682821）的cDNA全长和完整开放阅读框（ORF）对应的gDNA序列。序列分析表明：该基因无内含子,cDNA序列含有一个672 bp的ORF,编码223个氨基酸残基序列。荧光定量PCR结果表明：LcTLP在花中表达量最高,其次是果皮,在果肉中表达量最低;在果实发育过程中,果皮中LcTLP表达量先上升后下降,采后果皮中的表达量高于采前,炭疽菌侵染诱导LcTLP的表达,失水和低温能抑制LcTLP的表达。     

铁皮石斛DoCDPK基因的克隆与表达分析

利用RACE技术和RT-PCR相结合,从铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）中克隆得到长度分别为1 863和1 729 bp的钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase）基因DoCDPK1与DoCDPK2的cDNA全长序列,开放阅读框分别为1 539和1 536 bp,编码512和511个氨基酸,编码蛋白表现为亲水性,结构稳定,二级结构主要由α–螺旋和无规卷曲构成。qRT-PCR分析结果表明DoCDPK1和DoCDPK2主要在铁皮石斛叶片中表达;4 ℃低温和400 mmol · L^-1 NaCl处理后,DoCDPK1和DoCDPK2在各个时间点上（2、4、8、12和24 h）的表达量有不同程度提高,而100 mmol · L^-1 ABA处理后DoCDPK1和DoCDPK2的表达量呈现不同变化趋势,推测DoCDPK1和DoCDPK2参与低温等非生物胁迫的响应。     

甜椒甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析

 用RT-PCR技术从甜椒(Capsicum annuum ) 中克隆了甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因的cDNA序列, 其全长为1 791 bp, 开放阅读框架为1 392 bp, 编码463个氨基酸, 命名为CaGPAT。序列分析表明该基因与番茄中的甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因同源性最高; 在进化上与番茄最先聚类, 其次是菠菜。Northern杂交结果显示, CaGPAT在甜椒各器官中表达量差异较大, 叶片中的表达量明显高于根、茎、花及果实。低温诱导该基因快速表达, 8℃下处理3 h该基因表达量最高, 12 h以后基因表达量下降; 而高温对基因表达没有明显影响。当温度低于15℃时基因表达被诱导。结果表明甜椒叶绿体CaGPAT的表达量与低温关系密切。     

‘库尔勒香梨’PsPL基因的克隆与表达分析

【目的】分离和克隆‘库尔勒香梨’(Pyrus sinkiangensis Yu)果胶裂解酶(pectate lyase,PL)基因Ps PL,了解其在香梨果实不同时期转录水平上的表达差异,为香梨果实成熟软化机制研究提供理论依据。【方法】以‘库尔勒香梨’果肉组织为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术得到Ps PL c DNA全长序列,并利用生物信息学方法对其进行分析和功能预测。运用实时荧光定量(q RT-PCR)技术,分析Ps PL基因在香梨果实生长发育后期及货架期的表达特性和差异。【结果】Ps PL基因c DNA全长序列为1 245 bp,Gen Bank收录号为KJ547669,该基因共编码414个氨基酸,属于果胶裂解酶家族基因,与其他植物PL基因编码的氨基酸序列有较高的同源性,与苹果同源性最高,达到97%;Ps PL在不同时期香梨果实中的表达差异很大,在生长发育后期表达量很低,盛花后150 d表达量最高。【结论】同源克隆了‘库尔勒香梨’Ps PL基因,可能在该梨果实软化过程中起到作用。     

柚苦味形成相关基因CmLGT的克隆与分析

为研究柚苦味形成的分子机理,以梁平柚为材料,采用PCR和RT-PCR技术扩增获得了柠檬苦素类化合物葡萄糖转移酶(LGT)基因CmLGT的DNA序列和cDNA序列。cDNA长1536bp,推测的编码蛋白CmLGT包含511个氨基酸,理论分子量为57.5ku,具有1个含有44个氨基酸残基的UDP-葡萄糖结合域(UDP-glucose Binding Domain),2个含有4个氨基酸残基的保守糖基化位点。扩增得到的CmLGT基因DNA和cDNA存在26个碱基的差异,可能是DNA和cDNA分别进行扩增时,其模板为同一位点上的等位基因造成的。     

芹菜非特异性脂转移蛋白基因的克隆与表达分析

 以芹菜（Apium graveolens）‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和‘美国西芹’为试验材料,采用RT-PCR 技术分别获得其cDNA 序列。序列分析表明：来源于3 个芹菜品种的非特异性脂转移蛋白（Non-specific lipid transfer protein,nsLTP）基因核苷酸序列高度保守,全长357 bp,编码118 个氨基酸,起始密码子ATG 之后含有27 个氨基酸残基的信号肽序列,推测其成熟的蛋白含91 个氨基酸残基,预测其蛋白质分子量为11.75 kD,pI 值为9.36。芹菜的nsLTP 蛋白主要由α–螺旋和随机卷曲组成。空间结构上分析显示,芹菜nsLTP 蛋白中H1 区域明显分为H1a 和H1b 两个亚区域,而模板碧桃中H1 区域为一个连续的螺旋结构,存在明显的差异。进化分析显示,芹菜nsLTP 与香石竹、大洋洲滨藜等植物的nsLTP相似性较高,在保守位置具有8 个半胱氨酸残基。实时定量PCR 表达分析表明,该基因主要在芹菜的茎以及茎尖生长活跃中心表达,具有明显的组织特异性。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

草莓FaMDHAR和FaGR的克隆与表达分析

为了探讨草莓中单脱氢抗坏血酸还原酶（Monodehydroascorbate reductase,MDHAR）和谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,GR）基因的功能,采用同源克隆的方法从‘丰香’草莓中克隆得到cDNA全长序列,并采用实时定量PCR方法对其在不同组织和不同发育阶段果实中的表达模式进行分析。结果表明：草莓MDHAR基因cDNA（FaMDHAR,GenBank登录号：KP025946）全长1 305 bp,编码434个氨基酸,分子量约为47 kD,含有保守的FAD结合结构域,定位于细胞质中。GR基因cDNA（FaGR,GenBank登录号：JQ339738）开放阅读框全长1 491 bp,编码496个氨基酸,分子量为53 kD,定位于细胞质中。FaMDHAR在各组织中均有表达,在成熟果实中表达量最高,叶和花次之,根中最低;在果实发育过程中FaMDHAR在绿果期有相对较高的表达,随后急剧增加,到白熟期最高,之后下降并维持在相对稳定水平。FaGR在叶和花中表达较高,在成熟果实中较低;在果实发育过程中,表达量从小绿期呈现增加趋势,至转红果期达最高,随后逐渐下降,在成熟果实中较低。果实发育过程中酶活性变化呈现出与各自基因表达量相似的变化规律。经过4 ℃低温处理24 h后的草莓叶片中,FaMDHAR相对表达量较对照显著增加,而FaGR无显著变化。草莓中FaMDHAR和FaGR表达存在时空差异,并对低温逆境响应存在差异。     

换锦花LsMYB4基因的克隆与表达分析

以换锦花（Lycoris sprengeri）为材料,采用RT-PCR方法和RACE技术相结合的方法,从花瓣中克隆了MYB基因的cDNA全长序列,命名为LsMYB4。该序列全长793 bp,包含606 bp完整开放阅读框,编码201个氨基酸,具有明显的R2R3-MYB结构域,与中国水仙NtMYB相似性达96%。实时荧光定量PCR分析结果表明,LsMYB4在换锦花不同组织和不同花期均有表达,其中在花瓣中的相对表达量比叶中多9 ~ 10倍,在盛花期的相对表达量比花苞期多20倍。不同花色无性系花瓣中表达量存在差异,花色较浅的无性系高于其它无性系,推测LsMYB4在调控换锦花花色形成的过程中起着负调控作用。     

杧果Rab蛋白基因MiRab11的克隆及表达分析

根据前期对杧果（Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的Rab11 片段,采用RT-PCR结合RACE 技术,从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个Rab11 完整编码区序列,命名为MiRab11。其cDNA 全长902 bp,包含完整开放阅读框657 bp,编码218 个氨基酸。同源性分析表明MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为97%）。实时荧光定量检测结果表明：MiRab11在杧果叶、茎、花和果实中均有表达,在嫩茎和花后70 d 的成熟果实中的表达较高;在果实形成及发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中表达量明显上调;逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起在叶或茎中上调表达;不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果表明,MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。     

黄瓜贝壳杉烯氧化酶基因CKO 的克隆及其表达分析

 以‘戴多星’黄瓜为试材,应用同源克隆和RACE技术从茎尖中得到赤霉素合成的关键酶--贝壳杉烯氧化酶（KO）基因cDNA全长序列,命名为CKO,GenBank登录号为JN792591,其长度为1 895 bp,开放阅读框（ORF）编码519个氨基酸,相对分子量为59.211 kD,等电点（PI）8.45。氨基酸同源性分析发现,CKO与苦瓜的KO同源性最高,达84%;序列结构分析表明,CKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域。实时荧光定量分析表明,CKO在遮荫的徒长苗中表达量最高,是正常苗的5.18倍,在遮阴条件下喷施多效唑可降低期表达。     

芹菜NAC转录因子基因AgNAC1的克隆及其对非生物胁迫的响应

通过RT-PCR方法,从芹菜‘六合黄心芹’和‘文图拉’中分别克隆获得编码NAC转录因子的基因AgNAC1。利用生物信息学方法分析其编码氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等,采用荧光定量PCR技术检测基因在不同非生物胁迫下的表达水平。结果表明：‘六合黄心芹’和‘文图拉’AgNAC1开放阅读框长度均为957 bp,编码318个氨基酸,其蛋白质相对分子量分别为36.89和36.77 kD,理论等电点分别为5.94和5.78。AgNAC1蛋白与不同植物中NAC家族成员同源性比对和进化树分析表明,其与胡萝卜DcNAC属于同一个分支,进化距离最近。蛋白功能域预测显示,AgNAC1有多个α螺旋和β转角二级结构单元。荧光定量PCR结果表明,AgNAC1在芹菜叶中表达量最高,具有组织特异性,同时对高温、低温、干旱和盐胁迫均有响应。‘六合黄心芹’中AgNAC1的表达水平在高温处理24 h达到最高。‘文图拉’中AgNAC1的表达水平在高温、低温及盐处理后2 h和8 h高于对照,呈现先下降后上升的趋势,在干旱处理4 h时表达水平最高。     

芋淀粉合成酶AGPase基因的克隆及表达分析

通过对‘靖江香沙芋’转录组数据进行功能注释,克隆获得‘靖江香沙芋’淀粉合成酶AGPase的基因,序列全长为1 596 bp,命名为CeApS1（NCBI：Colocasia KU288757,未公布）。该基因编码532个氨基酸,蛋白含有1个NTP_transf_3结构域（Gly¹⁰⁴ ~ Pro³⁰⁶）和1个PbH1结构域（Gly⁴⁷³ ~ Ser⁵¹⁵）,编码产生AGPase小亚基,等电点和分子量分别为6.73和57.6 kD。ApS1在单子叶和双子叶植物中广泛存在,CeApS1与紫萍（AIZ00992.1）中相应蛋白的亲缘关系最近,相似性为83.4%,与草莓（AAS00541.1）、苜蓿（XP_003617925.1）、水稻（AAK27313.1）和小麦（CAA46879.1）等植物中相应蛋白的亲缘关系较远。CeApS1在‘靖江香沙芋’的母芋和子孙芋中表达量较高,在叶片、叶柄和根中低表达。芋球茎中的CeApS1表达水平与球茎发育密切相关,在播种160 d后达到最大值。该基因的表达模式与球茎淀粉含量的积累显著正相关。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

茶树LEAFY基因的克隆和表达分析

以茶树（Camellia sinensis）大叶且无蕾不开花的突变体‘大叶龙’及其母株为材料,通过同源克隆结合RACE-PCR方法,克隆了LEAFY（LFY）同源基因的全长cDNA序列,两种序列分别命名为CsLFL1和CsLFL2,其cDNA全长分别为1 448和1 466 bp,各自包含1 191和1 197 bp的完整开放阅读框,编码396和398个氨基酸。它们与漆树科、无患子科以及壳斗目（山毛榉目）一些物种的LFY同源序列具有77% ~ 79%的一致性,具有植物LFY成员作为转录因子的脯氨酸富集区、亮氨酸重复、酸性和碱性结构域以及保守的C–端等典型结构特征。系统发育分析表明,它们属于双子叶植物LEAFY分支,并且亲缘关系最近,说明两者的形成是发生在茶树物种进化过程中较晚期的复制事件。两种序列在正常开花母株及‘大叶龙’中没有区别,在母株花芽中强烈表达,在母株和‘大叶龙’叶芽中有微弱表达。这些结果说明CsLFL1和CsLFL2代表了茶树中LFY的同源基因,并且可能参与茶树的成花启动过程。