1S,2R-((3-溴苯乙基) 氨基)-N-(4-氯-2-三氟甲基苯基) 环己烷基-1-磺酰胺对灰葡萄孢的抑菌活性及作用方式

研究了磺酰胺类化合物1S,2R-((3-溴苯乙基) 氨基)-N-(4-氯-2-三氟甲基苯基) 环己烷基-1-磺酰胺 (代号SYAUP-CN-26) 的抑菌活性及防治病害的作用方式。结果表明,SYAUP-CN-26可抑制多种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发,尤以对灰葡萄孢Botrytis cinerea的抑制活性较强,EC₅₀值分别为1.82 μg/mL和14.98 μg/mL。20 μg/mL的SYAUP-CN-26处理能显著降低灰葡萄孢的产孢量、产菌核量,增加单菌核重。经该化合物处理过的灰葡萄孢孢子及菌丝致病力均降低。200 μg/mL的SYAUP-CN-26对番茄灰霉病的保护效果和治疗效果分别为83.11%和47.52%,保护作用优于治疗作用。     

2-氧代和2-羟基环烷基磺酰胺对14种病原真菌的杀菌活性

为了研究2-氧代和2-羟基环烷基磺酰胺类化合物的杀菌谱,选择N-(2-三氟甲基-4-氯苯基)-2-氧代和2-羟基环戊、己、庚、辛、十二烷基磺酰胺(A1～A5和B1～B5)共10个化合物,采用菌丝生长速率法测试了其对14种病原真菌的杀菌活性,并进行了初步的构效关系分析。在质量浓度50 mg/L下,2-氧代环庚、环辛烷基衍生物(A3、A4)和2-羟基环庚、环辛烷基衍生物(B3、B4)的杀菌谱接近或宽于对照药剂百菌清。精密毒力测定结果表明,化合物A3和B3对小麦赤霉病菌Gibberella zeae (Schw.) Petch、棉花黄萎病菌Verticillium dahliae等8种病原菌的EC50值均在20 mg/L以内。2-氧代和2-羟基对该类化合物杀菌活性的影响基本一致,7、8员环化合物的活性明显高于5、6员环和12员环化合物。     

2-氧代-2-苯基乙磺酰胺化合物组合合成与杀菌活性研究

为了快速获得具有高效杀菌活性的先导化合物,利用组合化学与传统合成方法相结合的方案,研究了N-取代-2-氧代-2-苯基乙磺酰胺类化合物对灰霉病菌的杀菌活性。首先以苯乙酮为原料,经过磺化、氯化反应,制备得到2-氧代-2-苯基乙磺酰氯,再分别与苯胺、苄胺和烷基胺组合库反应,制备了33个组合库,其中包含105个化合物,收率在60%~90%之间,纯度在70%~95%之间。筛选其中的10个活性库进行平行合成,得到29个化合物,又对其中10个活性化合物进行了纯化与结构鉴定。最后用灰霉病菌Botrytis cinerea对所有组合库与化合物进行离体与活体双重筛选,快速确定了高活性先导化合物,为进一步的结构优化奠定了基础。     

丁香酚对灰葡萄孢的抑制作用研究

丁香酚是从植物中提取的天然化合物。采用菌丝生长速率法测定了其对多种植物病原真菌的抑制作用以及田间分离得到的7株灰葡萄孢Botrytis cinerea对丁香酚的敏感性,同时测定了丁香酚对B.cinerea 03 孢子和菌核的抑制活性。结果显示,丁香酚对多种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用;灰葡萄孢不同菌株对丁香酚的敏感性不同,EC50值在29.97 ~83.62 μg/mL之间;丁香酚可抑制灰葡萄孢产孢,但对孢子萌发无影响,可抑制其菌核的产生和萌发。荧光染色结果表明丁香酚能破坏灰葡萄孢菌丝细胞膜。利用原子吸收光谱法和紫外分光光度法分别测定丁香酚处理前后菌丝培养液中K+浓度和OD260值变化,结果显示处理后K+浓度和OD260值均升高。综上所述,细胞膜可能是丁香酚对灰葡萄孢菌丝的作用位点。     

2-噻唑酰氨基环己烷基磺酰胺的合成与杀菌活性

为进一步研究环烷基磺酰胺类化合物的杀菌活性与构效关系,在前期工作基础上,合成了11个未见文献报道的2-噻唑酰氨基环己烷基磺酰胺类化合物 ( 7a ~ 7k ),其结构均经1H NMR、13C NMR、质谱和元素分析确证。分别采用菌丝生长速率法、黄瓜活体叶片法、孢子萌发法和番茄活体盆栽法对目标化合物进行了生物活性测定。结果表明:目标化合物对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea表现出较好的抑制活性,其中化合物 7a 和 7c 在10 mg/L下对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制率分别为90%和67%;在200 mg/L 施药剂量下,对活体黄瓜叶片、番茄叶片和番茄花上灰霉病的防治效果,化合物 7a 分别为75%、78%和30%,化合物 7c 分别为78%、62%和44%,均优于对照药剂腐霉利,有进一步研究的价值。     

2-吡啶酰氨基环己烷基磺酰胺的合成与杀菌活性

为了进一步研究环烷基磺酰胺类化合物的杀菌活性与构效关系,在前期工作基础上,对先导化合物进一步展开研究,合成了15个未见文献报道的2-吡啶酰氨基环己烷基磺酰胺类化合物。首先以2-氧代环己烷基磺酰胺为原料,经过还原胺化后得到2-氨基环己烷基磺酰胺;再与取代吡啶甲酰氯反应,得到目标化合物。分别通过菌丝生长速率法与黄瓜活体叶片法测定了目标化合物对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea及其他5种植物病原菌的杀菌活性。结果表明:目标化合物对番茄灰霉病菌表现出较好的抑制活性,其中化合物V-8在离体条件下对番茄灰霉病菌的EC50值为1.41 mg/L,在500 mg/L下的活体防效为79.17%;此外,部分目标化合物在50 mg/L下,对水稻纹枯病菌、水稻稻瘟病菌、大豆根腐病菌、黄瓜绵腐病菌和辣椒疫霉的抑制率高于60%,其中,化合物V-7对黄瓜绵腐病菌的EC50值为2.7 mg/L,其活性高于对照药剂多菌灵（EC50值为4.4 mg/L）,有进一步研究的价值。     

2-酰氧基环己烷基磺酰胺的组合合成与杀菌活性

为了快速获得具有杀菌活性的先导化合物,按照苯环上取代基的性质,将18个N-取代苯基-2-羟基环己烷基磺酰胺分成8个大小不等的原料库(A),分别与过量的2-乙氧基乙酰氯(B1)和4-氟苯甲酰氯(B2)反应,获得16个2-酰氧基环己烷基磺酰胺类组合库。通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和红外光谱分析了组合库中36个化合物的结构和含量。以番茄灰霉病菌Botrytis cinerea Pers.为供试靶标,菌丝生长速率法测试结果表明:当A的苯环上含有多个Cl或CF3等吸电子基团时,与B1反应生成的组合库的活性普遍较高,其中活性组合库A5B1、A6B1和A7B1的杀菌活性均高于对照药剂腐霉利;黄瓜离体叶片试验表明,活性组合库A6B1和A7B1的防效也与腐霉利相当。在组合库生物活性筛选中化合物的结构、含量和数量是影响筛选结果的3个因素,其中结构为主要因素。     

地衣芽孢杆菌W10对灰葡萄孢的抑制作用及其抗菌物质

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）W10是一株对多种植物病原菌有抑制作用的拮抗细菌，对番茄灰霉病的田间防效与化学药剂腐霉利相当，可达60％以上。该菌株除了对病菌有较强的抑制作用外，还具有在番茄植株体表定殖竞争能力、诱导植株产生系统抗性能力。但地衣芽孢杆菌W10对灰葡萄孢的作用方式和产生的抗菌物质种类尚不清楚，为此作者进行了该项研究。现将研究结果报道如下。     

致病杆菌CB43菌株对灰霉病菌的抑制作用

测定了致病杆菌CB43菌株代谢物对灰葡萄病菌菌丝生长和孢子萌发的影响。结果表明:CB43代谢物对灰葡萄孢菌丝生长有较强的抑制作用,500、250、125ml/L代谢物能完全抑制菌丝的生长,并具有杀死作用。62.5ml/L的发酵液处理灰葡萄病菌菌丝72h的抑制率仍达83.35%。20ml/L的发酵液处理灰葡萄孢菌丝能引起菌丝畸形,异常分支、粗短。CB43代谢物能杀死灰葡萄孢分生孢子或抑制其萌发,500~62.5ml/L的发酵液处理16h后,孢子萌发抑制率达88.1%~97.91%。温室试验表明,CB43代谢物对黄瓜灰霉病的控制效果达84.09%,化学农药40%施佳乐的效果为72.94%。     

不同温度下纳他霉素对灰葡萄孢的抑制活性和作用机理初探

采用菌丝生长速率法测定了不同温度下纳他霉素和乙霉威对灰葡萄孢Botrytis cinerea的抑制活性,同时采用药液培养法间接测定了不同温度下药剂对菌丝体糖、蛋白和电解质渗漏的影响。结果表明:纳他霉素对菌丝生长的抑制中浓度(EC50)在25℃下为37.42 μg/mL,在5℃下为0.984 0 μg/mL,活性提高了37倍;乙霉威对供试菌的活性在5℃下较25℃提高了5倍。25℃下经纳他霉素处理8 h后,菌丝体可溶性糖渗漏量为6.5 mg/g,蛋白渗漏量为162 μg/g,药液电导率为700 μs/cm,均显著高于相同条件下的0.1%吐温-80对照和乙霉威处理。不同处理温度之间,温度越低菌丝内含物的渗漏量越少。     

竹红菌甲素对番茄灰霉病菌的抑制作用

为研究竹红菌甲素(HA)对番茄灰霉病菌的抑制作用,分别采用菌丝生长速率法、电导率法、紫外分光光度法和电镜观察法研究了HA对番茄灰霉病菌抑制率以及其对电导率、蛋白质和核酸相对泄漏度、菌丝形态与超微结构的影响。结果表明:在黑暗条件下,HA对番茄灰霉病菌无明显抑制作用;但在12 000 lx光照条件下,抑菌作用显著,EC50值为17.16 mg/L,且随着HA浓度上升,抑菌率呈极显著增加趋势,40 mg/L下抑菌率达73.9%;番茄灰霉病菌细胞相对电导率、蛋白质与核酸相对泄漏度随HA浓度上升而明显升高;电镜观察可见,经34.32 mg/L的HA处理后,大多数菌丝出现畸形、膨大或缢缩等现象,细胞器几乎全部消失,细胞内出现大面积空腔,细胞遭到严重破坏。研究结果可为HA开发成绿色高效生物农药提供理论依据。     

抗啶酰菌胺蔬菜灰霉病菌突变体的诱导及其生物学性状

为评价蔬菜灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性风险,采用紫外线照射和药剂驯化相结合的诱导方法,对蔬菜灰霉病菌D9、L17、J9亲本敏感菌株进行了室内啶酰菌胺抗性诱导,并采用菌落直径法比较了抗、感菌株在生物学性状方面的差异。结果显示,共获得不同抗性水平的突变体23株,其中突变体D9-4的抗性倍数为253.76倍,达高抗水平。突变体菌丝生长速率较敏感菌株有所下降,抗、感菌株的适宜生长温度均为25 ℃,敏感菌株最适pH为5,突变体最适pH为7,突变体适应酸碱度和温度变化的能力较敏感菌株差;低抗突变体产孢量和孢子萌发率与敏感菌株无显著差异,但高抗突变体产孢量和孢子萌发率较敏感菌株显著降低;在无药条件下,敏感菌株致病力强于抗性突变体,而在药剂胁迫下,突变体表现出一定的耐药性,致病力强于敏感菌株;6株突变体无药继代培养15代后,突变体抗性稳定遗传。此外,蔬菜灰霉病菌对啶酰菌胺与其它5种杀菌剂之间没有交互抗性。研究表明,蔬菜灰霉病菌抗啶酰菌胺突变体适合度较低,但在药剂选择压力下容易形成啶酰菌胺抗性群体,在生产中需引起注意。     

两种季铵盐阳离子表面活性剂对番茄灰霉病菌的毒理效应

为探讨季铵盐阳离子表面活性剂1227和C8-10对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的毒理效应,运用电子显微镜、氧电极、紫外-可见分光光度计等测定了1227、C8-10对番茄灰霉病菌分生孢子萌发、细胞壁结构、呼吸作用和三种细胞壁降解酶的影响,并在番茄叶片活体上接种经药剂处理的番茄灰霉病菌,观察药剂对其侵染活性的影响.结果显示,两种季铵盐阳离子表面活性剂5μg/mL处理可使分生孢子芽管变短变粗、基部明显膨大,显著抑制聚甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸酶和羧甲基纤维素酶的活性,并可显著影响番茄灰霉病菌在番茄活体叶片上的侵染活性;40μg/mL处理可导致菌体细胞壁表面出现多处破损、细胞内含物聚集等现象;100μg/mL处理显著抑制分生孢子的呼吸作用;250μg/mL和1 000μg/mL处理对病原菌菌丝呼吸产生破坏作用.说明两种季铵盐杀菌剂高剂量能够破坏菌体细胞壁结构,导致番茄灰霉病菌呼吸完全停止和死亡,而低剂量可以抑制细胞胞壁降解酶的活性,降低其致病力.     

Activity and metabolism of cyano-oxime derivatives in various strains of Botrytis cinerea

The fungitoxicity of cymoxanil, 4 cyano-oxime analogs (in which the acetylurea group was replaced with various groups: amide, ester, propargyl, and cyanomethyl-amide), and 2 cymoxanil-metabolites was studied against various strains of Botrytis cinerea. The fungicidal effect was measured on germ-tube elongation and mycelial growth. Cymoxanil and the analogs bearing the amide and ester groups showed the best anti-botrytis activity. The strains studied can be classified into 3 groups according to the germ-tube sensitivity to cyano-oximes. These groups fitted well with the 3 phenotypes of sensitivity to cymoxanil previously characterized in our laboratory: CyaS₁ (highly sensitive phenotype); CyaS₂ (moderately sensitive phenotype); and CyaR (tolerant phenotype). The bio-transformations of all the cyano-oximes were monitored in the culture-medium of the different strains using HPLC- and IP-HPTLC-methods. HPLC-studies showed that cymoxanil and the analogs bearing the groups amide and ester were quickly metabolized in the culture-medium of the CyaS₁ strain. Moreover, these studies allowed us to correlate disappearance of these cyano-oximes, to their fungicidal activity towards the CyaS₁ strain. This suggests that cyano-oximes and particularly cymoxanil are probably activated in a fungitoxic compound. IP-HPTLC-studies strengthened the precedent results and allowed us to correlate disappearance of cyano-oximes studied with appearance of two acids metabolites of hydrolysis. These metabolites could be the actual active-principles.     

哈茨木霉菌与啶酰菌胺联用对番茄灰霉病菌的增效机制

为验证哈茨木霉菌与啶酰菌胺联用对番茄灰霉病菌的增效作用,采用显微镜观察法观察了菌药联用后哈茨木霉菌和番茄灰霉病菌的菌丝形态,用菌丝生长速率法和圆盘滤膜法测定了菌药联用后哈茨木霉菌挥发性物质、非挥发性物质和粗酶液对番茄灰霉病菌的抑菌活性.结果显示:啶酰菌胺对哈茨木霉菌的菌丝基本无影响,但能使灰霉病菌的菌丝发生间断性溶解;菌药联用后哈茨木霉菌挥发性物质对灰霉病菌的最高抑菌活性为61.17％,而哈茨木霉菌和啶酰菌胺单独对灰霉病菌的抑菌活性分别为48.79％、0.97％,表现增效作用;菌药联用后哈茨木霉菌非挥发性物质和粗酶液对番茄灰霉病菌的抑菌活性未明显增强.研究表明,啶酰菌胺与哈茨木霉菌联用的增效机制是啶酰菌胺导致灰霉病菌的菌丝部分溶解,同时增强了哈茨木霉菌挥发性物质对灰霉病菌的抑菌活性.     

天然化合物丁香酚对灰葡萄孢菌丝脂质过氧化和膜损伤的影响

研究了天然化合物丁香酚对灰葡萄孢菌丝细胞膜的影响。结果表明,丁香酚可以作用于真菌的膜系统,诱导菌丝膜脂质过氧化,使膜受到损伤,透性改变,丙二醛(MDA)流出细胞。进一步研究发现,丁香酚处理使得菌丝内过氧化氢含量逐渐升高;菌丝内钙离子浓度先升高,30 min后逐渐下降,这可能是由于细胞膜破损导致钙离子外流的缘故。同时,通过DNA梯状条带的检测,初步表明丁香酚不能诱导灰葡萄孢菌丝细胞凋亡。     

纳他霉素对灰葡萄孢不同生育阶段菌体的毒力及其生物学性状的影响

以多菌灵为对照药剂,采用生长速率法、悬滴法和浸渍法分别测定了不同温度下纳他霉素对灰葡萄孢Botrytis cinerea菌丝生长、分生孢子萌发和菌核萌发的毒力,研究了常温下两种药剂对菌株产孢和菌核形成的影响。结果表明:纳他霉素及多菌灵对灰葡萄孢不同生育阶段菌体的抑制作用随温度降低而有不同程度增强;分生孢子对药剂最为敏感;温度对药剂对菌丝毒力的影响最显著;多菌灵对菌株不同发育阶段的抑制活性均高于纳他霉素。供试药剂对菌株产孢时间和菌核产生时间无显著影响,但多菌灵可显著刺激菌株产孢和菌核形成。     

一氧化氮对果蔬采后灰霉菌生长发育及致病性的影响

为探讨NO的抑菌效果,以硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)为NO供体,进行番茄活体接种试验,研究外源NO处理对采后灰霉菌Botrytis cinerea生长发育及致病性的影响,并通过胞内抗氧化相关酶活性和丙二醛(MDA)含量以及活性氧水平的检测,探讨其作用机制.结果显示,SNP的最低抑菌浓度为4 mmol/L;SNP处理灰霉菌5h后,与对照组相比,孢子萌发率、芽管长度分别降低56％和25 μm,菌丝扩展速度下降31％;胞内过氧化氢酶、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶活性分别下降30％、42％、38％、40％,脂氧合酶活性和MDA含量分别提高48％和67％;SNP处理灰霉菌后接种番茄6d,发病率下降22％,病斑直径减小12 mm;胞内活性氧积累约为对照组的3倍.表明NO能够显著抑制灰霉菌的生长发育,其抑菌机制是通过诱导灰霉菌胞内活性氧积累引起氧化损伤.     

灰葡萄孢多药抗性菌株的筛选和鉴定

从浙江杭州市售草莓上分离得到83个灰葡萄孢菌株,测定了这些菌株对苯醚菌酯、多菌灵和异菌脲的敏感性,筛选出对这3种药剂同时产生了抗性的两个菌株HZ021和HZ054,其在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上的菌丝生长和产孢量与敏感菌株相比无显著差异,在黄瓜叶片上均表现出很强的致病力。结果表明,HZ021和HZ 054有很高的适合度。通过对抗性菌株中细胞色素b (CYT b)、双组份组氨酸激酶(OS-1)和β-微管蛋白(TUB 2)基因序列进行分析发现,HZ021和HZ054对多种药剂的抗性是由于其药剂靶标基因上的点突变所致。