大豆种子特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从大豆中克隆得到β-伴球蛋白α亚基基因的启动子序列7αP,并对其进行功能分析。【方法】利用PCR技术从大豆基因组DNA中分离β-伴球蛋白α亚基基因启动子序列7αP,将其与GUS基因融合,构建种子特异性表达载体p7αP-GUS,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,对再生植株进行PCR、Southern blot检测和GUS组织化学分析。【结果】序列分析表明,7αP长度为1 382 bp,其中含有多种种子特异性启动子的序列元件,如RY重复序列元件、E-box、SEF1-motif、SEF4-motif(、CA)n、Dc3启动子结合因子和ACGT序列元件及一些诱导物应答元件。转基因植株的PCR和Southern blot结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,仅能在种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶等其他组织中均未检测到GUS活性。【结论】大豆β-伴球蛋白α亚基基因上游1 382 bp片段具有种子特异性启动子功能,7αP为种子特异性启动子。     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

豆荚特异性启动子Pmsg的克隆及抗大豆食心虫植物表达载体的构建

植物基因工程载体构建时,一般采用组成型启动子,因涉及转基因食品安全性问题,在社会上引起争议。采用组织特异性启动子代替组成型启动子,既可调控下游基因的表达又能解决转基因食品安全性问题。采用同源克隆方法从栽培大豆绥农14中克隆了2 278 bp的豆荚特异性启动子Pmsg,与GenBank上的大豆msg基因启动子序列相似性为99%。构建了由启动子Pmsg调控经人工改造、具有抗大豆食心虫功能的基因(Cry1Iem)的表达载体pBMBt,以及由种子特异性启动子PGy2调控Cry1Iem基因的表达载体pBGBt,为抗大豆食心虫基因工程研究奠定了重要基础。     

棉花种子特异性启动子的克隆及序列分析

启动子是基因表达的重要顺式调控元件,在基因工程中,种子特异性启动子可以调控外源基因在种子中特异表达,提高表达效率,增强转基因的效果。本试验根据棉花LEA蛋白D34基因序列设计引物,以海岛棉基因组DNA为模板,通过touch down PCR技术,获得D34基因的种子特异性启动子片段。测序结果表明该片段长1 384 bp,与已发表的D34基因序列相似度为94.87%。该片段除了含有启动子的基本元件TATA框、CAAT框外,还含有种子特异性启动子元件E-box、G-box、B-box、AACA基序等。此外,对其顺式元件做了生物学功能分析。     

大豆种子特异性启动子的分离及结构分析

 采用PCR技术从大豆品种吉林43基因组DNA中分离到大豆β-伴球蛋白α-亚基基因启动子片段（BCSP666）。序列比较和分析表明，这一启动子片段与其它两个大豆种子特异性启动子--β-伴球蛋白α′-亚基基因启动子片段和β-伴球蛋白β-亚基基因启动子--片段在序列结构上有很大的相似性，并具有多种种子特异性启动子所特有的序列元件，据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。Δ6-脂肪酸脱氢酶是亚油酸脱氢形成γ-亚麻酸的限速酶。将启动子片段BCSP666与深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）连接，构建种子特异性表达载体pBMI666。通过农杆菌介导法转化大豆子叶节，在转基因愈伤组织中表达了脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）,获得γ-亚麻酸，初步验证了启动子片段BCSP666的启动子活性。     

玉米ZmMYB59基因启动子的克隆及功能分析

为研究ZmMYB59基因启动子的表达模式,以玉米自交系‘B73’幼苗基因组DNA为模板,克隆ZmMYB59基因2个启动子片段分别命名为MYB59-P-1、MYB59-P-2,构建GUS植物表达载体pCXGUS-MYB-1K,pCXGUS-MYB-2K,并通过农杆菌介导法转化水稻‘日本晴’获得GUS植物表达载体转基因植株。通过PlantCARE软件进行生物信息学分析,发现ZmMYB59基因启动子中具有ABRE和CCGTCC-box等重要的顺式作用元件。GUS染色结果显示:1)pCXGUS-MYB-1K的种子没有着色,表明其未驱动GUS在种子中表达,pCXGUS-MYB-2K的种子胚乳边缘着色,表明其驱动的GUS在种子胚乳边缘表达;2)种子萌发期pCXGUSMYB-1K只有芽尖着色,表明其仅驱动GUS在芽尖表达,pCXGUS-MYB-2K芽尖和根均着色,芽尖着色较深,根维管束细胞少量着色,表明其驱动的GUS主要在芽尖表达,而在根部维管束组织中表达较弱;3)苗期pCXGUSMYB-1K,pCXGUS-MYB-2K植株的根、茎、叶均能着色,但后者着色较深,表明ZmMYB59基因的启动子可能是组成型启动子,同时也说明MYB59-P-1是启动子发挥正常调控功能所必须的,但启动能力不强,推测MYB59-P-2中可能存在增强启动子表达的顺式作用元件。     

水稻胚特异表达基因Os08PTS启动子的克隆及分析

为分析编码磷脂酰肌醇转移蛋白基因Os08PTS在水稻种子发育中的功能及利用Os08PTS启动子进行遗传改良.依据T-DNA插入位点信息,克隆Os08PTS基因启动子,并利用生物信息学手段分析Os08PTS启动子的顺式作用元件特征,同时构建启动子与GUS融合表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因植株,验证启动子的表达特征....     

烟草根特异性启动子TobRB7的分离及克隆

从烟草品种“NC89”中提取总DNA,设计特异性引物,用PCR方法分离得到长度为670bp左右的烟草根特异性启动子TobRB7基因,井插入克隆载体pMD18-Tvector,为构建高效的植物表达载体奠定基础。     

拟南芥AtNUDT2启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成1对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT2上游非编码区,并将其与pBAR－GUS3相连,构建了植物表达载体pNUD12P－GUS,采用以农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株（2周幼苗）进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3．5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT2启动子,且该启动子为组成型表达启动子;病原菌Pst．DC3000及风t．DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。     

甘蓝型油菜启动子pBnaC05g31880D的克隆与功能分析

以甘蓝型油菜冬性品种中双11的基因组为模板,克隆了BnaC05g31880D基因起始密码子上游-1 525 bp的启动子序列。顺式调控元件的预测分析表明,该启动子含有真核生物启动子必需的核心调控元件TATA box和CAAT box,同时还存在较多的其他功能元件,如光信号响应调控元件ATCT-motif、Box 4、ACE、I-box、LAMP-element、TCT-motif,厌氧感应必需的顺式作用元件ARE,茉莉酸甲酯响应顺式作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif,玉米醇溶蛋白代谢调控元件O_2-site,赤霉素响应元件P-box等。为了验证该启动子的表达模式,构建了由其驱动GUS报告基因的植物融合表达载体DX2181G-pBnaC05g31880D,并采用农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥(Col-0)。对筛选和鉴定的阳性转基因株系进行GUS组织化学法染色,结果表明,GUS活性在拟南芥的各个组织中均有较强表达水平,这表明pBnaC05g31880D具有驱动GUS报告基因在拟南芥各个组织中组成型表达的特性。这为该启动子在油菜转基因提高作物品质和人工创建种质资源等方面的应用提供了较好的基础。     

大豆豆荚光合特性及其对产量的贡献

以大豆东农42、东农163为试验材料,对不同生育期豆荚和叶片的光合速率、蒸腾速率、水分利用效率、气孔导度、叶绿素含量、可溶性蛋白含量等生理指标进行了研究,并通过在鼓粒始期R5、鼓粒期R6、生理成熟期R7对豆荚进行遮光处理,研究豆荚对籽粒重的影响。结果表明,豆荚具有光合作用的能力,光合速率在生理成熟期R7最高;蒸腾速率、气孔导度随着生育期的延续呈下降趋势,而水分利用效率逐渐上升;整个测定生育期内,东农42、东农163豆荚叶绿素含量分别占其叶片的7.63%和7.25%,可溶性蛋白含量占其叶片的53.47%和48.82%;在鼓粒始期R5进行遮光处理表明,豆荚的光合产物对籽粒重的贡献率达到7.34%~15.06%。     

2022 年 2 期目录

  目的  SPL（SQUAMOSA promoter binding protein-like）是植物特有的转录因子,参与植物幼年期向成年期的转变、营养生长向生殖生长的转变、花发育、孢子发生、叶片和根发育、逆境响应等多个过程,在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。探究白桦中BpSPL6基因启动子区的顺式作用元件,以及该启动子在正常和胁迫条件下的表达模式,可为进一步研究BpSPL6基因的功能提供参考,也可为了解白桦的抗逆机制提供依据。  方法  以本实验室组培白桦的总DNA为模板,经PCR克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列,用PLACE和Plant CARE在线软件分析启动子区的顺式作用元件。构建BpSPL6基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体并转化拟南芥,探究其组织表达特性和胁迫条件下的表达模式。  结果  PCR成功克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列,对启动子区的顺式作用元件预测发现除了含有核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还包括2种特异组织表达元件（根、花粉）,10种激素响应元件（生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸）,4种脱水响应元件等。对转基因拟南芥进行GUS染色结果表明,BpSPL6基因启动子驱动的GUS基因在转基因拟南芥中的表达具有时空特异性。在拟南芥的整个发育过程中,BpSPL6基因启动子驱动GUS基因在真叶叶片中表达,但是表达部位不同。随着叶片的生长,首先在叶片的顶端表达,随后扩展到叶片的叶脉并直至整个叶片,并且表达量逐渐升高。同时BpSPL6基因启动子驱动的 GUS 基因在拟南芥营养生长时期的根部都有表达。并且经氯化钠和甘露醇胁迫后其表达量降低。对比两种胁迫,受到氯化钠胁迫后GUS基因的表达量变化更大,说明对氯化钠胁迫的响应更加强烈。  结论  BpSPL6基因可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应。      

水稻胚乳特异表达启动子DXCP35的克隆及功能鉴定

根据水稻全生育期基因表达谱芯片数据库找到1个在水稻胚乳特异表达的基因,命名为DX35,用PCR技术从水稻品种明恢63基因组中克隆得到其上游1 356bp长度的启动子DXCP35。将DXCP35与β-glucuronidas(GUS)报告基因融合后,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化获得转基因水稻阳性植株,通过组织化学染色法证明DXCP35是1个胚乳特异表达启动子。对其进行5′端缺失分析,构建了6个缺失载体,通过验证缺失载体的表达谱,证明308bp长度的启动子就足以维持胚乳特异表达模式。     

水稻胚乳特异型双向启动子的克隆及功能鉴定

以水稻中的1对双向转录基因(TIGR Locus:LOC_Os09g39540和LOC_Os09g39550)的翻译起始位点之间的序列作为研究对象,克隆其序列并进行功能鉴定。以明恢63基因组DNA为模板,采用PCR法扩增该序列(命名为BDP1),以正反两个方向插入启动子功能分析载体pDX2181,分别命名为BDP11和BDP12;转基因阳性植株的GUS组织化学染色结果证明该启动子为胚乳特异型的双向启动子,两端的表达水平均很低。将启动子片段距离转录起始位点较短的一端向下游延伸123bp(命名为BDP2),以正反两个方向插入启动子功能分析载体pDX2181,分别命名为BDP21和BDP22;转基因阳性植株的GUS组织化学染色结果显示该启动子的胚乳特异型双向表达模式维持不变,表达水平高于BDP1。     

拟南芥AtWRKY33基因启动子的克隆及表达分析

以野生型拟南芥为材料,采用PCR技术克隆得到了拟南芥AtWRKY33基因起始密码子ATG上游1 629 bp启动子序列,并利用该启动子驱动GUS基因在野生型拟南芥中表达,对获得的转基因拟南芥采用重金属Cd处理不同时间,进行GUS染色及定量分析。结果表明：AtWRKY33基因启动子与GUS融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达;拟南芥植株中的AtWRKY33基因在根中大量表达;定性与定量实验均显示经重金属Cd处理后的拟南芥幼苗中AtWRKY33基因随着时间增加而被显著诱导表达。说明该基因响应重金属Cd胁迫。     

1个新水稻组成型启动子的克隆与功能鉴定

根据基因芯片数据库和RT-PCR验证得到1个高活性的水稻组成型表达基因(TIGR Locus:LOC-Os07g34589),用PCR技术从籼稻品种明恢63基因组中克隆得到其上游启动子PSUI1,长度为1 941bp;将其与β-glucuronidase(GUS)报告基因融合构建植物表达载体DX2181b-PSUI1,利用玉米Ubiquitin启动子融合GUS报告基因构建表达载体DX2181b-PUbi作为对照,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将DX2181b-PSUI1和DX2181b-PUbi转化粳稻品种中花11。组织化学染色表明,含DX2181b-PSUI1的转基因植株中,GUS基因在幼苗期叶片、叶鞘、根,抽穗期叶片、叶鞘、茎秆、颖壳、雄蕊和成熟期的叶片、叶鞘、茎秆、胚、胚乳中均有表达,说明PSUI1为组成型启动子。对GUS表达活性进行定量分析表明,PSUI1启动子的活性约为玉米Ubiquitin启动子活性的1/3～1/2,但是PSUI1表现出了更好的表达稳定性。